[发明专利]一种基于纳米金与核酸结构的靶分子检测方法

说明书

技术领域

本发明特别涉及一种基于纳米金与核酸结构的靶分子检测方法。

背景技术

核酸适体(aptamer)是指利用上个世纪末建立而发展起来的SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)体外筛选技术，从随机寡核苷酸文库中筛选获得的短单链寡核苷酸配基，它能够与靶分子特异结合，从而本身发生构象变化。

通过体外筛选技术，理论上可筛选到任意物质的核酸适体，再加上高通量筛选的技术特点与核酸适体精确识别、易体外合成与修饰等特性，使得核酸适体在分析化学与生物医药研究方面具有广阔的应用前景。例如，核酸适体在生物传感器的设计中具有重要作用，被应用于生物学、环境、安全等领域的检测，包括蛋白质(凝血酶、生长因子、HIV相关多肽等)、有机小分子(cAMP、ATP、可卡因等)和金属离子(K+、Hg²⁺、Pb²⁺等)，其他新的令人兴奋的应用包括基于核酸适体的蛋白质芯片，和在蛋白质组学中用于高通量成像、基于DNA酶和RNA酶的分子尺度的逻辑DNA分子计算机等。

除此之外，还有一些其他的DNA序列也可以在某一特定环境下发生构象变化。核酸适体和这些DNA对各自的靶物质来说都有其特异性的核酸结构，可与靶物质发生特异性反应，从而本身发生构象的变化。

这种核酸结构在遇到相应的靶分子进行结合时通常会伴有明显的构象变化。这种结构的差异形成了基于核酸结构传感器的理论基础。一个典型的基于核酸结构的传感器包括一个双标记的寡核苷酸序列(电子传递或能量传递的受体和供体)，因此，靶分子结合导致的结构变化可以直接影响到受体和供体之间的距离，从而可以高灵敏度的检测到电信号或光信号的产生。在此基础上，核酸结构在分析化学方面的应用逐渐成为人们关注的焦点，例如，Tan等将核酸适体应用于分子信标研究，发展了一种高效、高灵敏检测生物分子的方法—分子aptamer信标(MAB)，并进一步用于凝血酶和血小板源生长因子(PDGF)的检测。另外，由于核酸适体与抗体具有类似的特异结合性质，因此在ELISA、免疫学分析、Western印迹法和生物传感器等许多应用中具有更大的发展潜力，并取得初步结果。

目前这种基于DNA构象变化的分子信标的方法，主要是应用双标记核酸序列，一端标记荧光基团，另一端标记猝灭基团，而猝灭基团又主要以Dabcyl(4-[4′-二甲基胺基苯基氮]安息香酸)为主。为了进一步提高荧光猝灭效率和检测的灵敏度，科学家们不断的研究开发新型的猝灭剂。近年来，科学家们通过研究发现与常规猝灭基团DABCYL相比，纳米金可以在可见到近红外的波长范围内，有效地猝灭各种荧光染料，猝灭率达到90％以上。

纳米金颗粒在生物学中的应用非常广泛，目前，核酸结构-纳米复合物在分析检测中的应用也受到了关注。1996年，Mirkin和Alivisatos所在工作组分别报道了纳米金-DNA复合物的重要应用，并将其发展为基于纳米结构的新型检测平台。通过深入了解金胶独特的光学和电学性质，Mirkin等人随后发展了一系列方法对DNA和蛋白质进行超微量检测。他们的方法依赖于巯基DNA探针在金胶表面的修饰，当加入靶时，可以引起金胶的团聚或解聚，从而引起宏观上颜色的红-蓝变化。Huang等用纳米金颗粒(GNPs)与核酸适体5’端的-SH直接作用形成的结合物(即Apt-AuNPs)来检测PDGF及其受体(PDGFR)，发现由于Apt-AuNPs具有简易性和专一性，所以非常适合于蛋白质分析和癌症诊断。Parlor等还将Apt-AuNPs用于光学检测凝血酶。Dwarakanath等将荧光性能优异的半导体纳米晶粒-量子点用于标记核酸适体，开辟了量子点技术与SELEX技术联合使用的先河。Korgd等通过生物素和抗生物素的作用将前列腺专一性膜抗原(PSMA)的核酸适体连接到具有近红外发光性能的CdTe量子点上来检测前列腺癌细胞，取得了较好的结果，这给核酸适体量子点标记在活细胞及生物体内的分析检测提供了新思路。但是这些方法主要是基于纳米金和HS-DNA的组装来进行的，由于DNA需要标记，而且组装的过程较为繁琐，耗时长、成本高，不利于推广应用。