[发明专利]人可溶性鸟苷酸环化酶的高效制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白表达领域，涉及一种用生物工程高效制备人的 可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的方法。

背景技术

生命体中内源性化学小分子NO、CO、H₂S、H₂O₂等作为细胞信号转导分子在 心血管系统和神经系统中有非常重要的生理功能。基于这些化学小分子的信号 转导分子机制及其与疾病诊断治疗和创新药物开发研究是近几年来化学生物 学和生物医学领域研究的一个前沿热点。可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)作为信 使分子NO的受体，是由α和β两个亚基组成的含有血红素的异源二聚体。当NO 与sGC的heme结合后可以激活sGC催化GTP转化为二级信使分子cGMP，进而 介导一系列的生物级联反应。

对于NO如何激活sGC提出了较多的模型，但是其确切机理仍然不清楚， 原因主要是由于不能得到足量的高纯度的sGC蛋白，另一方面sGC全蛋白比较 大(α约80kDa和β约70kDa)，从而阻止了人们对于其结构-功能-性质-反应的 深入研究。

目前sGC蛋白的获得途径主要有两种：一是从组织当中提取，但是这种方 法提取得到的量很少(～2mg/kg牛肺)，对于人的sGC蛋白来说更是由于组织 来源的限制而变得几乎不可能。第二种途径是从真核细胞中表达：这种方法蛋 白产率低(～130μg/25ml细胞提取液)，成本相当高。虽然有细菌体的sGC血 红素结构域在大肠杆菌中表达的报道，但是它们与真核生物的血红素结构域同 源性很低。对于真核生物的sGC蛋白，只有Marletta等人在大肠杆菌中表达 了小鼠的β1亚基的血红素结构域和催化结构域，但是他们所得到的可溶性蛋 白的产量相当低。到目前为止还没有人的sGC蛋白在大肠杆菌中表达的报道。

发明内容

本发明的目的是建立一种操作简单，成本低，产率高，纯度高的人的可溶 性鸟苷酸环化酶(sGC)的制备方法。

本发明提供了一种人可溶性鸟苷酸环化酶的高效制备方法，该方法包括以 下步骤：

(1)将人可溶性鸟苷酸环化酶核苷酸编码序列装入表达载体，并转化表达 用大肠杆菌菌株；

(2)将(1)所得菌株接种于改进后的TB培养液，IPTG诱导表达过夜；

(3)将(2)所得菌体破菌，离心，过Ni-NTA柱，tev酶酶切，过Ni-NTA 柱，heme重组即可。

本发明的方法中，(1)中所述表达载体可以是pMAL-c2x、pET28b或者 pET22b。

本发明的方法中，所述表达载体可以为MBPHT-mCherry2质粒。

本发明的方法中，(1)中所述大肠杆菌菌株可以是BL21(DE3)pLysS、 Rosetta(DE3)pLysS或者Rosetta(DE3)。

本发明的方法中，(3)中破菌方法可以是超声、反复冻融或者溶菌酶酶解。

本发明的方法中，“人可溶性鸟苷酸环化酶核苷酸编码序列”是指编码具 有人可溶性鸟苷酸环化酶的核苷酸序列(GENBANK登陆号：NM_000857)，如序 列中开放阅读框位置核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于 NM_000857序列的编码框开放阅读框位置核苷酸中，有一个或多个密码子被编码 相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与 NM_000857序列的编码框开放阅读框位置核苷酸序列同源性低至约70％的简并序 列也能编码出NM_000857所述的序列。

在本发明中，术语“人可溶性鸟苷酸环化酶核苷酸编码序列”指具有人可 溶性鸟苷酸环化酶活性的如上述序列对应的多肽。该术语还包括具有与上述蛋白 具有相同功能的变异形式。这些变异形式包括：若干个(通常为1-50个，较佳地 1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以 及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内， 更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进 行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一 个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人可溶性鸟苷酸环 化酶的活性片段和活性衍生物。