[发明专利]一种人细胞色素c的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种用生物工程高效制备人细胞色素c的方法。

背景技术

多年来人们一直认为细胞色素c只是一种电子传递蛋白，对其研究工作多集中于马心细胞色素c与酵母细胞色素c等。人细胞色素c由于来源困难，研究极少。但是近年来，人们发现细胞色素c与细胞凋亡以及细胞氧化压力有着重大关系。这两个过程与目前困扰人类的多种重大疾病，如癌症、帕金森症等都有着直接关联。因此，人细胞色素c对于生物医药领域有着重要的潜在应用价值。

现有技术一直难以得到高纯度的全长人细胞色素c。首先，人基因组中有至少49条细胞色素c的假基因，这使得人细胞色素c的cDNA克隆非常困难。另外，细胞色素c蛋白的合成过程中还需要其它酶的辅助，从而将血红素辅基共价连接到肽链上。这些都给人们制备细胞色素c全蛋白带来了很大困扰。Jeng等曾于2002年在酵母细胞色素c的基础上进行基因改造，制备出N端甲硫氨酸缺失的人细胞色素c蛋白，产量约10-15mg/L菌液。Olteanu等于2003年在马心细胞色素c的基础上进行基因改造，得到的是N端甲硫氨酸缺失的以及全长细胞色素c蛋白的混合蛋白，全长细胞色素c蛋白仅占总蛋白的1/10，总产量约8mg/L。目前还没有高产量的全长细胞色素c蛋白制备方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单，成本较低，产率高，纯度高的全长人细胞色素c的制备方法。

本发明提供了一种人细胞色素c的制备方法，包括人细胞色素c核苷酸编码序列与表达载体连接构建重组质粒，然后转化基因工程菌培养扩增并分离纯化，基因工程菌扩增时接种于含2-4克/升的SB培养液。

本发明的方法中，所述表达载体可以是pBTR1或者pBTR2。

本发明的方法中，所述表达载体可以是pBTR-fd质粒。

本发明的方法中，所述基因工程菌可以是Rosetta(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)或者BL21(DE3)pLysS。

本发明的方法中，基因工程菌扩增温度可以为35-40度，时间可以为18-28小时。

本发明的方法中，所述分离纯化过程可以是将扩增培养后的菌体依次经过超声破菌，离心，盐析，透析，过柱和脱盐过程。

本发明的方法中，所述过柱可以是上清液通过CM-52阳离子交换柱，再通过CM-琼脂糖高通量阳离子交换柱或者葡聚糖凝胶树脂柱(或Mono-S柱)。

本发明的方法中，扩增培养时，培养液可以用塑料膜封口。

本发明的方法中，“人细胞色素c核苷酸编码序列”是指编码具有人细胞色素c的核苷酸序列NM_018947，如序列中开放阅读框位置的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于NM_018947序列的编码框开放阅读框位置核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与NM_018947序列的编码框开放阅读框位置位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出NM_018947所述的序列。

在本发明中，术语“人细胞色素c核苷酸编码序列”指具有人细胞色素c活性的上述编码序列对应的多肽。该术语还包括具有与上述蛋白具有相同功能的变异形式。这些变异形式包括：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人细胞色素c的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式还包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、人细胞色素c核苷酸的融合蛋白、以及利用抗人细胞色素c核苷酸血清获得的多肽或蛋白。

本发明的方法中采用的表达载体和菌株可以采用该领域常用的表达载体和宿主菌，例如pBTR-fd质粒和大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS，pBTR1和Rosetta(DE3)，pBTR2和BL21(DE3)pLysS。

把人细胞色素c编码序列装入载体并转化菌株可以采用常规的方法。例如，在人细胞色素c编码序列5‘和3’加入载体上已有的酶切位点，从而将编码序列插入载体的多克隆位点处。转化可采用热激转化。