[发明专利]分支杆菌的鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域临床分子诊断技术，尤其涉及一种使用PCR测序的分支杆菌的鉴定方法。

背景技术

分支杆菌的数量目前有110种左右，它是许多统称为分支杆菌病的疾病的起因。因此，分支杆菌的分类鉴定引起了广大的科研工作者的重视。。现有技术中，分支杆菌的鉴定技术分为三类。

一类是采用常规生化指标鉴定分支杆菌，例如专利CN1298023所描述的。这种方法也是目前检验科常用的方法，这种方法鉴定时间长(需要1-2周)，鉴定的结果受人为观察的影响，准确性不是很高。

第二类采用抗原抗体的方法进行血清学诊断，例如专利CN1388378就是采用这种方法，该方法能够检测的分支杆菌数量同样比较少，而且每种菌需要一种抗体进行检测，因此不能鉴定临床相关的所有分支杆菌。

第三类采用芯片杂交技术(寡核苷酸杂交检测技术，即利用相关突变的寡核苷酸与受检对象DNA进行杂交来确定突变类型)。专利CN1724681，CN1896280，CN1071955都是此类技术，此类技术对实验条件要求高，结果不稳定，分型的种类较少，每种需要用一个探针。因此不利于临床标准化应用。而且芯片杂交的方法检测的分支杆菌数量有限。

因此本领域迫切需要开发一种鉴定种类多，结果稳定，结果分析方便准确，便于临床操作和结果标准化的分支杆菌鉴定方法

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种鉴定种类多，结果稳定，结果分析方便准确，便于临床操作和结果标准化的分支杆菌鉴定方法。

为实现上述目的，提供了一种分支杆菌的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：获取多种分支杆菌的多个标准rDNA序列，以生成分支杆菌序列数据库。对所述多个标准rDNA序列进行比对，得到这些rDNA序列共有的保守区段。根据所述保守区段制备一对PCR引物。使用所述PCR引物对待测分支杆菌的DNA溶液进行PCR扩增，从而得到所述待测分支杆菌的扩增产物。对所述扩增产物进行测序反应，得到测序产物。对所述测序产物进行测序分析，得到待测分支杆菌的rDNA序列。通过比较所述待测序列和所述分支杆菌序列数据库中的标准序列，确定所述待测分支杆菌的类型。

较佳地，还包括使得所述引物的3‘端的碱基与所述多种分支杆菌的rDNA序列匹配。

较佳地，所述一对PCR引物包括上游PCR引物agagtttgatcctggctcag和下游PCR引物ttgtcgcgttgttcgtgaaa。

较佳地，还包括对所述扩增产物进行纯化。

较佳地，，将所述上游PCR引物的浓度稀释到1uM，对所述纯化产物进行测序反应。

较佳地，，还包括对所述经测序反应的扩增产物进行乙醇沉淀。

较佳地，，还包括对所述经乙醇沉淀的扩增产物进行甲酰胺变性。

较佳地，通过毛细管电泳进行所述测序分析，得到所述待测分支杆菌的测序图谱。

较佳地，还包括将所述测序图谱转换为与所述分支杆菌序列数据库中的标准rDNA序列的格式相同的格式。

较佳地，所述比较所述待测序列和所述分支杆菌序列数据库中的标准序列，确定所述待测分支杆菌的类型还包括如下步骤：

获得所述分支杆菌序列数据库中与所述对待测序列最匹配的所述标准序列。获得待测序列与标准序列的共享碱基的百分比，所述百分比定义为匹配度。根据所述匹配度对所述分支杆菌序列数据库中的标准序列进行序，匹配度排序第一的序列判定为待测分支杆菌的类型。

较佳地，还包括获得相邻两位匹配度排序的两条标准序列共享碱基数的差，所述差定义为确信度；并且根据所述确信度对所述匹配度进行校正。

由于根据多种分支杆菌的标志序列的保守区段设计PCR引物，因此所有的PCR和测序只需一对引物，大大减少了实验种所需要的寡核苷酸的数量。

附图说明

图1为分支杆菌的PCR引物序列示意图；

图2为结果序列示意图；

图3为序列鉴定结果的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆：实验室手册(Sambrook等人，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。