[发明专利]用秀丽线虫测定药品与个人护理品的世代毒性的方法

权利要求书

1.用秀丽线虫测定药品与个人护理品类物质的世代毒性的方法，包括A，卵 液的制备：将秀丽线虫放在接种有E.coli OP50的线虫生长固体培养基上，23℃ 培养三天后用根据传统方法配制并灭菌的M9溶液冲洗含有秀丽线虫虫体的线虫 生长固体培养基得到虫液，将虫液转移至离心管中，静置30min，用移液枪移去 上清液，依据传统方法配制次氯酸钠溶液，按照虫液∶次氯酸钠溶液＝1∶7体积比， 将次氯酸钠溶液加入虫液中，混合摇匀，反应20min，每五分钟摇匀一次，杀死 母体，留下对次氯酸钠溶液有抵抗能力的虫卵，2500rpm离心3min，弃上清液， 再加入M9溶液至离心前相同的刻度，摇匀，2500rpm离心3min，弃上清液，重 复该操作两次，然后向离心管内加入M9溶液，摇匀，标记为卵液，待用；B，同 步化虫液的获得：将A步获得的卵液200μL接种到依照传统方法配制但并没有 接种E.coli OP50的线虫生长固体培养基上，培养1-2天至秀丽线虫四次蜕皮， 达到了生长状态相对同步化后，用线虫生长培养液冲洗培养基表面，将含有秀丽 线虫的溶液转移至已灭菌的离心管中；含有秀丽线虫的溶液浓度很高时需要稀 释，直至每100μL溶液中有10±1只秀丽线虫，标记为虫液，待用；上述线虫 生长培养液是按照线虫生长固体培养基的配方，但不使用琼脂粉配置得到的，若 线虫生长培养液能够使待测药品与个人护理品类物质的澄清溶液变浑浊，则使用 M9溶液代替本步骤的线虫生长培养液；C，制备用于测定半数致死浓度的药品与 个人护理品类物质样品：先确定待测药品与个人护理品类物质的溶解性及溶剂， 若药品与个人护理品类物质溶于水，则采用去离子水；若药品与个人护理品类物 质不溶于水，则采用体积百分浓度为1％的二甲亚砜作为溶剂，在待测药品与个 人护理品类物质的饱和溶液的浓度以下、根据等对数间距的原则配置十一个浓度 梯度的药品与个人护理品类物质样品，采用与待测药品与个人护理品类物质溶剂 相同的溶液作为空白对照，得到不同浓度的药品与个人护理品类物质样品十二 组，每组八个平行，共计96个样品；D，样品与虫液的混合：将C步获得的96 个样品加入96孔板中，每个孔内的样品量均为100μL，再向96个已经有100μL 样品的孔中各加入B步得到的虫液100μL；E，半数致死浓度的测定：采用体视 显微镜对D步的96孔板中的秀丽线虫进行观察，每4小时观测一次，虫体僵直 则认定其死亡，记录死亡数目，直至空白对照组的秀丽线虫出现幼虫/卵为止； 以浓度对数为横坐标，死亡率为纵坐标，采用直线内插法获得半数致死浓度，简 称LC₅₀；若所设定浓度梯度所产生的死亡率均小于50％，则保持待测药品与个人 护理品类物质样品空白对照组之外的最低浓度不变，适当增加所采用的等对数间 距，设定较高的浓度梯度；若所设定的浓度梯度所产生的死亡率均大于50％，则 保持待测药品与个人护理品类物质样品的最高浓度不变，适当增加所采用的等对 数间距，设定较低的浓度梯度；然后重复步骤A、B、D、E，直至获得LC₅₀，其特 征是：

F，用于测定世代毒性的待测药品与个人护理品类物质样品的制备 在步骤E获得的LC₅₀以下，根据等对数间距的原则设定十一个浓度梯度，采 用与待测药品与个人护理品类物质的溶剂相同的溶液作为空白对照，得到不同浓 度的样品十二组，每组设有8个平行样品，共计96个样品，待测；

G，重复A步和B步，获得同步化的每100μL溶液中有10±1只秀丽线虫的 虫液，待用；

H，待测药品与个人护理品类物质对亲代的毒性结果的测定

将步骤F获得的96个样品加入96孔板，加入量均为100μL；再向96个样 品中加入100μL由步骤G获得的虫液，暴露4h后，用移液枪移取十二组浓度中 每一组浓度的八个平行样品中的四个样品，置于同一个15mL离心管中，再向离 心管中加入4mL M9溶液，摇匀后静置10min，去上清液，再次加入4mL M9溶液， 摇匀后静置10min，再去除上清液，再加入适量M9溶液，使秀丽线虫保持5±1 只/50μL，23℃室温下，采用体视显微镜对亲代进行如下指标的测定：寿命，孵 化规模及世代时间，身体大小，身体弯曲频率，逆向运动，嗅觉刺激；其中，寿 命、孵化规模和世代时间同时测定，嗅觉刺激、身体大小、身体弯曲频率和逆向 运动同时测定，最后，采用待测药品与个人护理品类物质的浓度对数作为横坐标， 采用上述指标测定结果作为纵坐标，获得秀丽线虫在不同的药品与个人护理品类 物质浓度下暴露4h所受到的毒性结果，记录为4h待测药品与个人护理品类物质 对亲代的毒性结果；

I，待测药品与个人护理品类物质对子一代的毒性结果的测定

将进行H步待测药品与个人护理品类物质对亲代的毒性结果的测定时留下 的每一个浓度系列的剩余四孔也停止对待测药品与个人护理品类物质的暴露，用 移液枪将虫液从96孔板中取出，一个浓度系列的亲代置于同一个有E.coli OP50 的线虫生长固体培养基的培养皿上，因此进行同样4h的暴露时间的12个浓度系 列对应了12个培养皿，重复步骤A，获得亲代不同浓度组对应的卵液；重复步骤 B，获得子一代的虫液，重复步骤H，获得4h待测药品与个人护理品类物质对子 一代的毒性结果；

J，待测药品与个人护理品类物质对子二代的毒性结果的测定

将进行I步子一代的毒性结果的测定时留下的每一个浓度系列的剩余四孔 也停止对待测药品与个人护理品类物质的暴露，用移液枪将秀丽线虫虫液从96 孔板中取出，一个浓度系列的秀丽线虫置于一个有E.coli OP50的线虫生长固体 培养基的培养皿上，于是进行同样的4h的暴露时间的12个浓度系列对应了12 个培养皿，然后重复步骤A，获得子一代不同浓度组对应的卵液；重复步骤B， 获得子二代的虫液，重复步骤H，获得4h待测药品与个人护理品类物质对子二 代的毒性结果；

K，待测药品与个人护理品类物质暴露不同时间的世代毒性测定

将暴露时间修改为8h，重复步骤H、I、J，获得8h待测药品与个人护理品 类物质对亲代的毒性结果和待测药品与个人护理品类物质对子一代的毒性结果 以及待测药品与个人护理品类物质对子二代的毒性结果；依照上述步骤，将暴露 时间修改为12h、16h、20h、24h，共获得12h待测药品与个人护理品类物质对 亲代、子一代和子二代的毒性结果；16h待测药品与个人护理品类物质对亲代、 子一代和子二代的毒性结果；20h待测药品与个人护理品类物质对亲代、子一代 和子二代的毒性结果；24h待测药品与个人护理品类物质对亲代、子一代和子二 代的毒性结果；

L，世代毒性的评价

采用软件Origin 7.5对数据进行显著性分析：将同一个暴露时间下获得的 待测药品与个人护理品类物质对秀丽线虫亲代、子一代和子二代的同一个指标的 三个毒性结果进行显著性分析，分别将亲代与子一代、子一代与子二代进行比较： 若两个比较均得到显著差异的结果，则说明药品与个人护理品类物质对该指标具 有明确的世代毒性，并且其毒性效果随着世代增加而增强；若前者结果为非显著 差异而后者结果为显著差异，则说明药品与个人护理品类物质对该指标具有世代 毒性，但其世代毒性需要较长的时间才能够显现出来；若前者结果为显著差异而 后者结果为非显著差异，或者两个比较中均为非显著差异，则说明所测药品与个 人护理品类物质对该指标不具有世代毒性；对其它的指标通过相同的步骤进行显 著性分析，即可获得所测药品与个人护理品类物质对哪些指标具有世代毒性；在 不同的暴露时间下获得的待测药品与个人护理品类物质对亲代、子一代和子二代 的同一个指标的毒性效果的数据，采用同样的显著性分析的方法，用于进一步佐 证药品与个人护理品类物质对秀丽线虫该指标的毒性是否随着暴露时间的增加 而具有更强的世代毒性。