[发明专利]用秀丽线虫测定药品与个人护理品的世代毒性的方法

说明书

技术领域

用秀丽线虫测定药品与个人护理品的世代毒性的方法，涉及一种用秀丽线虫 测定药品与个人护理品类物质(PPCPs)的世代毒性的方法。属于环境保护、生 态风险评价等技术领域。

背景技术

秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)属于线形动物门、线虫纲动物，生活 在世界各地的泥土中，以细菌为食，容易人工养殖，对人、动物和植物没有危害， 非寄生，安全性高。它能感知气味和味道，对光线、温度有反应。秀丽线虫基因 组全序列测定在1998年底完成，是第一个已知基因组全序列的多细胞动物。现 在，已知的线虫基因组有97Mbp，相当于人类基因组的1/30。该模式生物具有 生命周期短、体积小、容易培养等诸多优点，易于在试验室中进行培养。另外， 秀丽线虫对外界环境的变化非常敏感，环境胁迫会改变它们的生殖速度、生命周 期以及其他发育特性。无论是利用胚胎发育来检测毒物的毒性试验，还是在分子 生物学水平对毒物进行分析，秀丽线虫都是比较可靠而有效的模式生物。秀丽线 虫是国内外研究的模式生物中最为简单、遗传与发育背景了解最清楚的物种之 一，已经在2002年和2006年获得诺贝尔生理学/医学奖，2008年获得诺贝尔化 学奖，这么短的时间获得三次诺贝奖，已经充分证明了秀丽线虫研究的优势，也 充分奠定了秀丽线虫丰厚的基础数据。

采用秀丽线虫作为毒性测试模式动物是很普遍的现象，诸多文献所采用的方 法均采用行为学的指标相似，而且对行为学指标的界定已经非常明确，但是对于 世代毒性的检测并没有非常明确，而且尚无文章提出对药品和个人护理品类物质 (PPCPs)采用线虫进行毒性测试的方法研究。

已经有很多文献报道，药品与个人护理品类物质(PPCPs)在全球环境中普 遍存在，无论是饮用水源、瓶装饮用水，还是污水处理厂的出水、普通江河湖泊 里的水均有检出。鉴于药品等物质能够增强环境中微生物对药品的抗性作用以及 药品等物质能够随着食物链等途径对人体发挥预想不到的作用，确定PPCPs的毒 性以及致毒机理至关重要。普通的急性毒性测试方法，虽然具有快速的优点，但 是由于其浓度的选择均明显高于环境中检出的PPCPs的浓度而无法判断真实环 境中的PPCPs产生的毒性效应，从而无法判断真实环境中的PPCPs所产生的生态 风险。而普通的慢性毒性，所检测的是PPCPs在其所选受试生物(比如小白鼠等) 生命期内某段时间所产生的毒性效应，无法表征PPCPs对生物、生物子代及其子 代的子代等的长期作用的毒性效应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方便快捷、成本低廉、操作简单的用秀丽线虫测 定药品与个人护理品的世代毒性的方法。

为了达到上述目的，本发明充分利用秀丽线虫已有的丰厚的基础数据，在急 性毒性和传统的慢性毒性测试方法的基础上进行进一步的研究，通过检测PPCPs 对秀丽线虫产生的世代毒性，能够测定待测PPCPs在很低的浓度条件产生的毒性 效果，并且能够判断得出该效果是否能够传递给下一代，而且通过检测指标可以 判断毒性效果的产生是基于对何种器官的刺激而引起的，以及对不同的器官产生 毒性作用的相对顺序，从而初步判断致毒机理。具体包括如下步骤：

A，卵液的制备：将秀丽线虫放在接种有大肠杆菌OP50(OP50 E.coli)的 NGM固体培养基上，23℃培养三天后用M9溶液冲洗得到含有秀丽线虫虫体的NGM 固体培养基得到虫液，将虫液转移至离心管中，静置30min，用移液枪移去上清 液，按照虫液∶clorox溶液＝1∶7体积比，将clorox溶液加入虫液中，混合摇匀， 反应20min，每五分钟摇匀一次，杀死母体，留下对clorox溶液有抵抗能力的 虫卵，2500rpm离心3min，弃上清液，再加入M9溶液至离心前相同的刻度，摇 匀，2500rpm离心3min，弃上清液，重复该操作两次，然后向离心管内加入M9 溶液，摇匀，标记为卵液，待用；

B，同步化虫液的获得

向依照传统方法配置但并没有接种OP50 E.coli的NGM固体培养基上接种上 述A步的卵液200μL，培养1-2天至秀丽线虫四次蜕皮后，其生长状态相对同 步化。与NGM固体培养基配方相同，不使用琼脂粉，配置NGM培养液，用于冲洗 固体培养基，将得到的含有秀丽线虫的溶液转移至已灭菌的离心管中，溶液中虫 浓度很高时需要稀释，直至每100μL溶液中有10±1只秀丽线虫，标记为“虫 液”，待用。