[发明专利]一种构建酵母双价通用表达载体的方法

权利要求书

1.一种构建酵母双价通用表达载体的方法，其特征在于构建酵母双价通用表达载体的方法按照以下步骤进行：一、根据酵母表达载体pYES2序列分别设计引物PGAL1-S、PGAL1-A、CYC1-S和CYC1-A，以质粒pYES2为模板、PGAL1-S和PGAL1-A为引物进行PCR扩增获得基因片段PGAL1，以质粒pYES2为模板、CYC1-S和CYC1-A为引物进行PCR扩增获得基因片段CYC1；二、将步骤一获得的基因片段PGAL1采用TA克隆方法连接到pMD18-T载体，得到质粒pMD18-PGAL1；三、将步骤一获得的基因片段CYC1和步骤二得到的质粒pMD18-PGAL1分别进行BamHI和XbaI双酶切后回收目的片段CYC1和质粒pMD18-PGAL1进行连接，获得质粒pMD18-PC；四、以步骤三得到的质粒pMD18-PC为模板、PGAL1-A和CYC1-S为引物进行PCR扩增，将扩增得到的目的片段和质粒pYES2分别用BamHI和EcoRI进行双酶切，双酶切后回收目的片段和质粒pYES2并连接；获得酵母双价通用表达载体pYES2-PC；其中步骤一中引物PGAL1-S的序列为5′-ACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAG-3′，引物PGAL1-A的序列为5′-CCGGAATTCGGTTTTTTCTCCTTGACGTTAA-3′，引物CYC1-S的序列为5′-CGCGGATCCATCATGTAATTAGTTATGTCACG-3′，引物CYC1-A的序列为5′-TGCTCTAGAAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCG-3′。

2.根据权利要求1所述的构建酵母双价通用表达载体的方法，其特征在于步骤一中以质粒pYES2为模板、PGAL1-S和PGAL1-A为引物进行PCR扩增的体系为20μL，由14μL的去离子水、2μL的10×Taq缓冲液、0.5μL浓度为10mmol/L的dNTP、1μL浓度为10mmol/L的引物PGAL1-S、1μL浓度为10mmol/L的引物PGAL1-A、0.5μL浓度为2.5U/μL的Taq DNA聚合酶和1μL的质粒pYES2组成；PCR反应条件：预变性94℃1min，变性94℃0.5min、退火57℃0.5min、延伸72℃1min，共38个循环，延伸72℃7min。

3.根据权利要求1所述的构建酵母双价通用表达载体的方法，其特征在于步骤一中以质粒pYES2为模板、CYC1-S和CYC1-A为引物进行PCR扩增的体系为20μL，由14μL的去离子水、2μL的10×Taq缓冲液、0.5μL浓度为10mmol/L dNTP、1μL浓度为10mmol/L的引物CYC1-S、1μL浓度为10mmol/L的引物CYC1-A、0.5μL浓度为2.5U/μL的Taq DNA聚合酶和1μL的质粒pYES2组成；PCR反应条件：预变性94℃1min，变性94℃0.5min、退火57℃0.5min、延伸72℃1min，共38个循环，延伸72℃7min。

4.根据权利要求1所述的构建酵母双价通用表达载体的方法，其特征在于步骤三中质粒pMD18-PGAL1进行BamHI和XbaI双酶切的体系为20μL，由1μL的BamHI、1μL的XbaI、2μL的10×M缓冲液、10μL浓度为0.1g/L的质粒pMD18-PGAL1和余量的去离子水组成；双酶切的反应是在37℃的条件下反应10～14小时。

5.根据权利要求1所述的构建酵母双价通用表达载体的方法，其特征在于步骤三中基因片段CYC1进行BamHI和XbaI双酶切的体系为20μL，由1μL的BamHI、1μL的XbaI、2μL的10×M缓冲液、10μL浓度为0.1g/L的基因片段CYC1和余量的去离子水组成；双酶切反应的条件为在37℃的条件下反应10～14小时。

6.根据权利要求1所述的构建酵母双价通用表达载体的方法，其特征在于步骤三中将回收的目的片段CYC1和质粒pMD18-PGAL1用T₄连接酶进行连接；连接体系20μL，由2μL的10×T₄DNA连接酶缓冲液、1μL浓度为2.5U/μL的T₄DNA连接酶、4μL浓度为0.1g/L的回收的目的片段CYC1、4μL浓度为0.1g/L的回收的质粒pMD18-PGAL1和余量的去离子水组成；连接反应条件为在4℃的条件下反应10～14小时。