[发明专利]一种构建酵母双价通用表达载体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种构建双价表达载体的方法。

背景技术

近些年来随着生物技术迅速发展，通过基因工程对生物进行有目的的改造已经成为了可能，但所报道多是对单个基因操作转化。然而自然界中生物许多性状往往是由多个基因控制，一般生化代谢途径需要多种酶催化作用才能完成，并且有时单个基因转化常表现为超强表达或抑制沉默，同时转入两个或两个以上起协同作用的基因对于转基因是迫切需要的。将目的基因构建在同一个表达载体上，多基因表达载体构建完成后，只需要通过一次转化就可方便地获得多价基因同时表达的转基因产物。现有构建双价载体的方法都是构建固定的双价载体，不能构建出可以表达任意目的基因的通用载体。

发明内容

本发明是为了解决现有构建载体的方法不能构建出可以表达任意目的基因的通用载体的问题，而提供一种构建酵母双价通用表达载体的方法。

本发明构建酵母双价通用表达载体的方法按照以下步骤进行：一、根据酵母表达载体pYES2序列分别设计引物PGAL1-S、PGAL1-A、CYC1-S和CYC1-A，以质粒pYES2为模板、PGAL1-S和PGAL1-A为引物进行PCR扩增获得基因片段PGAL1，以质粒pYES2为模板、CYC1-S和CYC1-A为引物进行PCR扩增获得基因片段CYC1；二、将步骤一获得的基因片段PGAL1采用TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)连接到pMD18-T载体，得到质粒pMD18-PGAL1；三、将步骤一获得的基因片段CYC1和步骤二得到的质粒pMD18-PGAL1分别进行BamHI和XbaI双酶切后回收目的片段CYC1和质粒pMD18-PGAL1进行连接，获得质粒pMD18-PC；四、以步骤三得到的质粒pMD18-PC为模板、PGAL1-A和CYC1-S为引物进行PCR扩增，将扩增得到的目的片段和质粒pYES2分别用BamHI和EcoRI进行双酶切，双酶切后回收目的片段和质粒pYES2并连接；获得酵母双价通用表达载体pYES2-PC；其中步骤一中引物PGAL1-S的序列为5′-ACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAG-3′，引物PGAL1-A的序列为5′-CCGGAATTCGGTTTTTTCTCCTTGACGTTAA-3′，引物CYC1-S的序列为5′-CGCGGATCCATCATGTAATTAGTTATGTCACG-3′，引物CYC1-A的序列为5′-TGCTCTAGAAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCG-3′。

用本发明的方法构建出的通用双价载体能够准确表达连接的基因，只需要将目的基因片段直接连接在本发明构建的通用双价表达载体上就可以准确表达，用本发明的方法构建出的通用双价载体构建表达两个目的基因片段的载体不需要中间载体，提高了构建双价表达载体的效率，节约了构建双价表达载体的时间，节约30％～40％的构建时间。

附图说明