[发明专利]慢病毒三链体DNA、及含有慢病毒三链体DNA的载体和重组细胞

说明书

发明背景

发明领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及病毒核酸和含有病毒核酸的细胞。更具体地，本发明涉及可以是三链体DNA结构一部分的病毒核酸序列，以及含有这些病毒核酸序列的核酸载体、病毒和细胞。本发明还涉及使用这些DNA结构和核酸序列的方法。

相关技术描述

在造血干细胞(HSC)中进行基因转移对于遗传性和获得性疾病的基因治疗和理解调节正常和病理血细胞生成的机制都有巨大的潜力。因为HSC具有广泛的增殖能力，所以稳定的基因转移应当包括转基因的基因组整合。基于莫洛尼鼠类白血病病毒(MoMLV)的逆转录病毒之所以非常流行，是因为它们整合到宿主细胞基因组中并能允许长期转基因表达。但是，这些肿瘤逆转录病毒不整合到非分裂细胞中，而大多数HSC是静止的。已经开发了许多利用不同细胞因子组合的预刺激方法来引发HSC的细胞周期，以便使它们能被肿瘤病毒来源的有丝分裂依赖性基因转移载体转导。但是，细胞因子刺激诱导增殖，也诱导分化，HSC的潜能可能会在转导过程中丧失。这个问题可通过使用慢病毒来源的载体解决，因为慢病毒已显示感染分裂和非分裂细胞(Poznansky等，1991；Naldini等，1996)。过去三年发表的使用这类慢病毒衍生载体转导HSC的最新报道显示很有前途，但结果差异很大(Case等，1991；Evans等，1999；Uchida等，1998；Miyoshi等，1999)。

慢病毒进化了一套允许其DNA基因组穿越宿主细胞核膜的向核输入策略。慢病毒的这种活跃的向核输入解释了它们在逆转录病毒中独特的能在非分裂靶细胞如组织巨噬细胞中有效复制的能力。肿瘤病毒如MoMLV的复制限于分裂细胞，似乎是由于需要在有丝分裂过程中核膜屏障的破坏，使MoMLV整合前复合物(PIC)能进入核(Roe等，1993)。在慢病毒体内复制策略开始、因而也是其致病性开始时慢病毒不依赖有丝分裂的复制已使得产生了具有治疗应用前景的慢病毒基因转移载体(Poznanasky等，1991；Naldini等，1996)。

慢病毒不依赖有丝分裂的复制最初是由VISNA慢病毒生产性感染非有丝分裂软骨样细胞证实的(Thormar，1963)。在其发现后不久，发现HIV在分化的初级巨噬细胞中复制(Gartner等，1986；Ho等，1986)。HIVDNA整合在非有丝分裂靶细胞的染色体(Weinberg等，1991；Lewis等，1992)，提示HIV-1PIC能跨越宿主细胞的核膜(Bukrinsky等，1992)。因此，不依赖有丝分裂的向核输入是负责慢病毒在非分裂细胞中复制能力的关键事件。

搜索负责HIV-1DNA基因组活跃向核输入的病毒决定因子已构成一个活跃而有争议的研究领域。在基质蛋白(MA)和Vpr病毒蛋白中存在推测的核定位信号(NLS)产生了如下主张，即它们可能以冗余的方式在HIV-1DNA向核输入中起作用(Bukrinsky等，1993b；Emerman等，1994；Popov等，1998；vonSchwedler等，1994)。已提出，一小部分(1％)MA分子在C-端酪氨酸残基处磷酸化触发它们从质膜释放和与HIV-1整合酶蛋白缔合(Gallay等，1995a；1995b)。这些蛋白质对HIV-1PIC的亲核特性的贡献目前是一个很有争议的问题(Freed和Martin，1994；Freed等，1995；Fouchier等，1997；Freed等，1997；Koostra和Schuitemaker，1999)。新近，已在整合酶蛋白(IN)中鉴定了NLS基序，且据报道这些基序中的突变消除IN与细胞NLS受体karyopherinα的相互作用(Gallay等，1997)。

发明概述

无论这些候选病毒蛋白在HIV向核输入中的作用如何，本发明显示，逆转录的HIV-1基因组本身带有其向核输入的顺式作用决定因子(cis-actingdeterminant)。

本发明提供含有三链(三链体)结构(如慢病毒的三链结构)的核酸。该三链体刺激核酸进入细胞核。该核酸可包含慢病毒的cPPT和CTS顺式作用序列。该慢病毒可以是任何慢病毒，包括但不限于HIV-1、HIV-2、VISNA、EINV、FIV、和CAE。在实施方案中，该核酸处在载体如表达载体中。

因此，本发明还提供载体，例如核酸载体。核酸载体可包括从本领域技术人员已知用于向细胞转移核酸或体内或体外核酸表达的任何载体来源的序列。

本发明还提供含有本发明核酸的病毒和细胞(真核细胞或原核细胞)。该细胞可以是重组细胞。