[发明专利]一种改构的人淀粉样多肽突变体－普兰林肽(pramlintide)的制备方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种改构的人淀粉样多肽突变体—普兰林肽(pramlintide)的制备方法。

背景技术

胰淀粉样多肽是一种有37个氨基酸残基构成的多肽激素，是一类包括CGRP和降钙素相关肽家族中的成员。为应答营养刺激素如葡萄糖和精氨酸，淀粉样多肽(Amylin)主要从胰腺β细胞合成并分泌(Moore等，Biochem BiophysRes Commun179：1-9，1991)。具有多种生理功能，如减慢食物(包括葡萄糖)在小肠的吸收速度，通过抑制高血糖素减少肝糖的产生，减少患者食欲，协助机体调节血糖水平等。淀粉样多肽(Amylin)分子具有两个重要的易位后限制：其C端是酰胺化的，以及在2位和7位上的半胱氨酸交联形成N端环。

天然的胰淀粉样多肽溶解性差，不稳定，易于水解，而且粘稠大，易凝集，因而不适合用于治疗。Pramlintide(普兰林肽)是经过筛选、合成出的一种稳定的胰淀粉样多肽类似物。两者的不同在于胰淀粉样多肽的氨基酸序列中的第25、28、29位的氨基酸由脯氨酸代替。胰淀粉样多肽的临床前研究和普兰林肽临床研究都表明，可以延缓葡萄糖的吸收，抑制胰高血糖素的分泌，减少肝糖生成和释放，同时能调节胃排空，减少胃肠道的葡萄糖，因而具有降低糖尿病患者体内血糖波动频率和波动幅度，改善总体血糖控制，并减轻体重的作用。

目前，制备普兰林肽的主要方法均是通过氨基酸合成的方法得到。普兰林肽为37个氨基酸，合成起来出错率高，在人体可能产生一定的副作用；而且合成的普兰林肽价格昂贵，给长期服用的病人造成了很大的经济负担。

小分子泛素样修饰蛋白(Small Ubiquitin-related Modifier，SUMO)，和泛素(ubiquitin，Ub)在一级结构上只有18％的同源性，然而两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。SUMO广泛存在于各种真核细胞中，参与调节细胞凋亡、信号转导、RNA转录、蛋白的核质运输以及细胞周期等多种生理进程(参见Johnson，E.S.2004，Annu.Rev.Biochem.，73，355-382.)。在脊椎动物中，有SUMO-1、-2、-3三个成员，而酵母和无脊椎动物仅有一个相关基因编码的SUMO。SUMO修饰蛋白的生理过程如图1。简言之，SUMO前体在泛素相似蛋白酶Ulps(ubiquitin-like proteases)的作用下失去C端的部分氨基酸残基，暴露出Gly-Gly序列，成为SUMO成熟肽；在ATP酶作用下，该成熟肽的C末端Gly与活化酶E1(SAE1/SAE2)的一个Cys残基通过硫酯键相连接；然后，SUMO经E1传递到结合酶E2(Ubc9)，并借助硫酯键与Ubc9活性位点上的Cys93残基相连接；在连接酶E3的作用下，SUMO的Gly通过异肽键与靶蛋白Lys残基的ε-氨基相结合并参与相关的生理活动；最后，通过Ulps的水解作用下，SUMO与靶蛋白分离。整个过程是一个动态迅速的反应。与泛素修饰不同，SUMO不会导致靶蛋白降解，而是通过改变靶蛋白的稳定性和亚细胞定位等调节靶蛋白的功能和生物活性。

除了上述的生物学活性外，SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，具有抗蛋白酶水解、显著增加重组蛋白表达量以及促进靶蛋白正确折叠，提高可溶性等功能。此外，Ulp1可以根据SUMO的三级结构迅速水解融合蛋白，而不象凝血酶、Xa因子及肠激酶等只能根据蛋白一级序列切割，因此能准确无误地切除SUMO，从而获得具天然N末端的靶蛋白且不会水解目的蛋白(Butt，etal.，2005，Protein Expression and Purification，43，1-9；US60/482817；PCT/US03/00436)。

发明内容

在本发明中，首先利用SUMO作为分子伴侣显著增加普兰林肽的表达量以及溶解度，促进其正确折叠，通过纯化标签纯化出表达的融合蛋白(SEQ ID NO：5)。然后通过Ulp1将SUMO和标签分开，得到纯化的普兰林肽。

本发明的一个目的是提供在大肠杆菌中可溶性表达人普兰林肽的重组载体，其中所说的表达载体包含T7启动子连接的编码带纯化标签的小分子泛素相关修饰因子成熟肽和普兰林肽融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。

根据本发明的表达载体，其中所说的融合蛋白包括：带纯化标签的小分子泛素相关修饰因子成熟肽和普兰林肽，且两种蛋白是从融合蛋白的N端到C端依次编码。

根据本发明的表达载体，其启动子为噬菌体T7启动子。