[发明专利]一种鸡防御素-1基因真核表达质粒及其使用方法

权利要求书

1.一种鸡防御素-1基因真核表达质粒，其特征在于由pcDNA3.1(+)真核表达载体、连接在pcDNA3.1(+)真核表达载体上的鸡防御素-1基因片段构成，该鸡防御素-1基因真核表达质粒的获得方法依次包括1、上游引物、下游引物的设置过程；2、鸡防御素-1基因片段的PCR获取过程；3、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程；4、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的制备过程；

（1）、上游引物、下游引物的设置过程：引物的设计及合成是根据国内外已在GenBank中登录的鸡防御素-1基因序列经多重比较后设计，并在5’端加入ATG启动子，根据真核表达载体pcDNA3.1(+)上的酶切位点，上游引物设计去掉了前导肽处开始，并加上Hind III酶切位点；下游引物设计在基因末端，并加上BamH I酶切位点，所需要的引物序列为：

上游引物：5’-cgAAGCTTaaaccatgGGAAGGAAGTCAGATTG-3’

下游引物：5’-TTGGATCCTCAgccccatattcttttgc-3’

（2）、鸡防御素-1基因片段的PCR扩增过程：以重组质粒pGEM-T-Gal-1为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上游引物、下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：5μL 的10×PCR buffer，2μL 的4×dNTPs，0.5μL的浓度为20μmol/L的上游引物，0.5μL的浓度为20μmol/L的下游引物，1μL 的pGEM-T-Gal-1质粒，40.5μL 的ddH₂O，0.5μL 的浓度为5μmol/L的ExTaq DNA聚合酶，反应过程是：a、混合物先在95℃处理3min；b、然后在94℃处理 45s，再在55℃处理 45s，再在72℃处理 1min；反应过程b循环30次；然后在72℃处理10min，重组质粒pGEM-T-Gal-1来源于华南农业大学动物科学学院家禽研究室所克隆并保存的重组质粒pGEM-T-Gal-1；所获得的鸡防御素-1基因片段核苷酸序列为：

atgggaaggaagtcagattgttttcgaaagagtggcttctgtgcatttctgaagtgcccttccctcactctcatcagtgggaaatgctcaagattttacc

；

    PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，见到130bp的扩增条带，表明已扩增到目标产物；

（3）、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程：将过程2的鸡防御素-1基因片段的PCR扩增产物用酚氯仿抽提纯化，加入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE溶解，TE溶解物用BamH I、Hind III进行双酶切处理，胶回收130bp的条带；以同样的方法对pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切处理，胶回收5.4kb的DNA片段，分别取5μL双酶切后胶回收的鸡防御素-1基因片段和3μL双酶切后胶回收的pcDNA3.1(+)质粒，加入1μL 的10×T4 DNA连接Buffer，1μL T4 DNA连接酶，在16℃下连接处理18小时，将连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养18小时；pcDNA3.1(+)质粒为Invitrogen公司的产品

a、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的双酶切鉴定：在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个的白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行双酶切鉴定；将鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1分别用BamH I、Hind III进行双酶切，酶切产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，pcDNA3.1(+)-Gal-1双酶切后产生5.4kb和130bp的两条带，证明已经成功构建了鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1；

b、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的PCR鉴定：在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行PCR鉴定；以质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：5μL 的10×PCR Buffer，2μL 的4×dNTPs，浓度均为20μmol/L的上、下游引物各0.5μL，pGEM-T-gal-1质粒1μL，ddH₂O 40.5μL，浓度为5μmol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5μL；反应过程为：a、95℃处理3min；b、然后94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 1min；反应过程b循环30次，然后72℃延伸10min，PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，可见130bp的扩增条带，证明已经成功构建了鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1；

（4）、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的制备过程：从过程3的LB固体培养平板中挑取单个白色菌落，接种于盛有10ml液体培养基的三角瓶中，37℃震荡过夜培养以获得菌种，然后在500ml的三角瓶中加入100ml的发酵培养基，接入2ml的菌种，在37℃，以200rpm/min速度摇晃，培养18h，然后用常规提取质粒的碱裂解方法对500ml三角瓶中的培养物进行质粒的大量抽提，用硅藻土吸附法进行纯化即可获得鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1。