[发明专利]大肠杆菌及其可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原的方法

权利要求书

1.一种大肠杆菌E.coli BL21/proMTG，其特征在于：该菌株保藏号为CCTCC M208240。

2.大肠杆菌可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原的方法，其特征包括如下步骤：

(1)转谷氨酰胺酶酶原基因的扩增及表达载体的构建：由原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原的核苷酸序列设计PCR引物进行PCR扩增，所述PCR引物的正向引物为SEQ ID No3所示，所述PCR引物的反向引物为SEQ ID No4所示，获得表达转谷氨酰胺酶酶原的基因片段，通过NcoI和XhoI双酶切，克隆到原核表达载体pET-22b(+)中，构建表达载体pET22-proMTG，并转化E.coli BL21(DE3)成为权利要求1所述的大肠杆菌；

(2)可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原：将权利要求1中所述的大肠杆菌E.coli BL21/proMTG先在36～38℃LB培养基中活化、培养12～14h，然后以体积百分比1％～2％的接种量接种到新鲜的LB培养基中，36～38℃发酵生长2～3h后降低培养温度到20～28℃，再加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达转谷氨酰胺酶酶原，诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷的浓度为0.4mM～1.0mM，诱导表达培养6～8h后结束培养收菌，超声波破碎细胞，离心后的上清液即为可溶性蛋白，含有转谷氨酰胺酶酶原；

(3)转谷氨酰胺酶酶原的激活：采用胰蛋白酶作为激活剂，对表达的转谷氨酰胺酶酶原激活成为成熟的转谷氨酰胺酶，以mg/ml计，胰蛋白酶的浓度为0.1％～0.2％，加入体积为酶原体积的1/10～1/20，作用时间为10～30min；

(4)高密度发酵：对权利要求1中所述大肠杆菌E.coli BL21/proMTG进行高密度发酵；前期菌体生长阶段的参数为温度36～38℃，溶氧控制在18～22％的饱和溶氧浓度，pH为6.5～7.5，待OD₆₀₀至50～60时，降低温度至20～28℃，加IPTG诱导表达，溶氧控制在28～32％的饱和溶氧浓度，pH 6.5～7.5，继续培养6～8h收菌；

(5)蛋白纯化工艺：对发酵的大肠杆菌用超声波裂解细胞后离心，上清液直接上亲和层析柱纯化蛋白，用高浓度咪唑洗脱目的蛋白，获得转谷氨酰胺酶酶原蛋白。

3.根据权利要求2所述的大肠杆菌可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原的方法，其特征所述的诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达转谷氨酰胺酶酶原的温度为22～24℃。