[发明专利]大肠杆菌及其可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原的方法

说明书

技术领域

本发明涉及转谷氨酰胺酶基因工程，特别是涉及大肠杆菌可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原的方法，实现转谷氨酰胺酶酶原的可溶性表达，用于大规模工业化生产转谷氨酰胺酶。

背景技术

转谷氨酰胺酶是一种催化酰基转移反应的转移酶，主要催化蛋白质和多肽进行谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行酰胺基转移反应，将蛋白质进行分子间的共价交联聚合，从而改变蛋白质本身和所附着的细胞、组织的结构与功能。该酶已在医药工业、食品工业和纺织工业等广泛利用，有“21世纪超级粘合剂”的美称，被认为是用于生产新型蛋白食品的最重要酶种，显示出显著的应用前景及优势，因而引起了人们的高度重视。在日本与MTG有关的食品销售额达2000亿日元，是日本单种酶销售额最大的一种。

国外在转谷氨酰胺酶特性及应用性的研究已经有很多报道，主要利用从动物器官组织中提取的酶样品进行试验。但由于动物组织来源少、提取工艺复杂、回收率低、产品成本过于昂贵的缘故，酶的生产应用一直受到很大限制。日本Ando等首先报道以轮枝链霉菌属发酵法直接生产微生物转谷氨酰胺酶(MTG)，将产品大批量投放市场，并获得了巨大的经济效益，吸引了国内外各方的广泛关注和极大兴趣。国内大量文献报道的是转谷氨酰胺酶应用的研究。中国食品酿造所、南京农业大学报道转谷氨酰胺酶生产菌的选育，其中中国食品酿造所进行微生物转谷氨酰胺酶生产菌的“神舟四号”飞船搭载育种。目前，主要通过两种途径来提高转谷氨酰胺酶的产量。一是通过诱变育种和培养基优化来提高生产菌的产量，如日本味之素公司就是采用茂原链霉菌发酵生产MTG，但是这种方法获得的高产菌很容易退化，生产不稳定；二是通过构建基因工程菌表达转谷氨酰胺酶，如在2005年9月第21卷第五期的《生物工程学报》发表的《茂原链霉菌转谷氨酰胺酶基因在大肠杆菌中高效表达》(作者：徐斌，韩之波，杨萍，刘拥军，李妍涵，韩忠朝)一文中就构建了基因工程菌成功地表达了转谷氨酰胺酶，文中报道利用PCR方法从茂原链霉菌基因组DNA扩增出微生物转谷氨酰胺酶的基因片段，而不是转谷氨酰胺酶酶原基因，并构建表达质粒pET-MTG。后者在大肠杆菌(Rosetta DE3)中得到高效表达，但表达的MTG存在于包涵体中，需要经洗涤、变性和复性等过程，并以强阳离子交换层析纯化，才获得了SDS-PAGE纯的 MTG，所以其过程是很繁琐，很难实现工业化生产。

发明内容

本发明克服了现有技术中的不足，本发明构建一株工程菌，通过低温发酵的方法实现了可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原，然后用胰蛋白酶激活后获得成熟的转谷氨酰胺酶，简化发酵生产工艺。

本发明的技术方案概述如下，包括如下步骤：

大肠杆菌可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原的方法，包括如下步骤：

(1)转谷氨酰胺酶酶原基因的扩增及表达载体的构建：由原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原的核苷酸序列设计PCR引物进行PCR扩增，所述PCR引物的正向引物为SEQ ID No3所示，所述PCR引物的反向引物为SEQ ID No4所示，获得表达转谷氨酰胺酶酶原的基因片段，通过NcoI和XhoI双酶切，克隆到原核表达载体pET-22b(+)中，构建表达载体pET22-proMTG，并转化E.coli BL21(DE3)成为大肠杆菌(Escherichia coli BL21/proMTG)，该菌株于2008年11月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 208240，该菌株能够高水平可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原。

(2)可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原：将权利要求1中所述的大肠杆菌E.coli BL21/proMTG先在36～38℃LB培养基中活化、培养12～14h，然后以1％～2％(v/v)的接种量接种到新鲜的LB培养基中，36～38℃发酵生长2～3h后降低培养温度到20～28℃，然后加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达转谷氨酰胺酶酶原，诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷的浓度为0.4mM～1.0mM，诱导表达培养6～8h后结束培养收菌，超声波破碎细胞，离心后的上清液即为可溶性蛋白，含有转谷氨酰胺酶酶原；

(3)转谷氨酰胺酶酶原的激活：采用胰蛋白酶作为激活剂，对表达的转谷氨酰胺酶酶原激活成为成熟的转谷氨酰胺酶，胰蛋白酶的浓度为0.1％～0.2％(mg/ml)，加入体积为酶原体积的1/10～1/20，作用时间为10～30min；