[发明专利]结核Esat6抗原基因的玉米表达载体及其应用

权利要求书

1、一种包含了结核Esat6抗原基因的玉米表达载体的构建方法，其特 征在于包括以下步骤：

(1)根据人结核分支杆菌H37Rv株Esat6基因的编码序列设计抗原基 因Esat6的1对引物：

上游引物序列为：P1 5′-GC ACTAGT ATGACAGAGCAGCAGTGGAA-3′，含 SpeI酶切位点和起始密码子ATG；

下游引物序列为：P2 5′-GC TCTAGA CTATGCGAACATCCCAGTGAC-3′， 含Xba I酶切位点和终止密码子CTA；

(2)以质粒pEGFPHsp65-Esat6为模板，用步骤(1)设计的引物P1和 P2进行常规链式聚合酶反应扩增Esat6；

(3)pCR-G载体的构建：

用HindIII和BamHI分别双酶切质粒pUBCG和经琼脂糖电泳 分离，从pUBCG酶切产物回收1.4kb的玉米种子特异表达启动子globulin-1， 从酶切产物回收3.9kb的载体片段，将两个回收片段连接、转化获 得重组质粒pCR-G；

(4)pCAMBIA1300-nos-bar载体的构建：

用SacI和EcoRI分别双酶切质粒pGFP-2和pUC18，经琼脂糖电泳分离， 从pGFP-2酶切产物中回收270bp的nos片段，从pUC18酶切产物中回收2.6kb 的载体片段，将两个回收片段连接、转化获得重组质粒pUC18-nos；用XbaI 和EcoRI酶切pUC18-nos，回收含有nos及多克隆位点的DNA片段，与经相 同处理的质粒pCAMBIA-1300连接、转化获得重组质粒pCAMBIA-1300-nos；

用XhoI酶切质粒pMDX1，回收560bp的bar基因片段，用XhoI切除质 粒pCAMBIA-1300-nos内潮霉素抗性基因，回收pCAMBIA-1300-nos并进行末 端脱磷酸；将bar基因片段与pCAMBIA-1300-nos连接、转化获得重组质粒 pCAMBIA1300-nos-bar；

(5)中间载体pCRGEsat6的克隆与构建：

用SpeI和XbaI分别双酶切步骤(3)所得质粒pCR-G和步骤(2)所得 Esat6，经琼脂糖电泳分离，纯化后进行连接、转化筛选获得重组载体 pCRGEsat6；

(6)目的载体pCAMBIA1300GEsat6的克隆与构建：

用HindIII和XbaI双酶切步骤(5)所得重组载体pCRGEsat6，得到 globulin-1和Esat6的联合片段，将HindIII和XbaI双酶切步骤(4)所得 pCAMBIA1300-nos-bar后的片段与上述联合片段连接、转化筛选获得目的载 体pCAMBIA1300GEsat6。

2、根据权利要求1所述玉米表达载体的构建方法，其特征在于：步骤 (2)所述常规链式聚合酶反应具体步骤如下：将混合液在95℃预变性5min， 然后进入下列循环：95℃、50s，56℃、50s，72℃、60s，共进行40个循 环，最后72℃延伸10min，扩增完毕后置4℃终止反应；所述混合液组成如 下：

浓度为10umol/l的上游引物P1                    1μl

浓度为10umol/l的下游引物P2                    1μl

dATP、dTTP、dCTP、dGTP的浓度

各为2.5mM的dNTP混合物                         4μl

pEGFPHsp65-Esat6                              1μl

Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液                   5μl

Ex耐热性DNA聚合酶                             0.3μl

灭菌水                                        37.7μl

3、根据权利要求1所述方法构建的玉米表达载体作为制备疫苗的用途。