[发明专利]结核Esat6抗原基因的玉米表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明公开了一种包含了结核Esat6抗原基因的玉米表达载体及其应 用，属于生物医学工程领域。

背景技术

结核病是一种严重危害人类健康的传染性疾病，由结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)感染引起。全球大约有三分之一的人感染 过结核(大约21亿)，每年新发病1000万人，卡介苗(BCG)作为预防结核病的 疫苗，近100年来虽然广泛用于新生儿的预防接种，但保护率只有50％左右， 而对成年人的保护率在不同地区，在0～80％之间波动；另外接种BCG还能使 少数人发生较严重的并发症，发生播散性感染而致死。鉴于结核病发生的严 重态势，加强结核病的防治工作、探索结核病的早期诊断及研制开发新型预 防、治疗的疫苗，已成为当前国际乃至我国关注的紧迫而优先的课题。

新型抗结核疫苗的研制，选取优势抗原最为重要。来源于结核分支杆菌 Esat6是一种非常重要的T细胞免疫原，是MTB培养早期分泌的相对分子质量 为6kD的早期分泌性抗原靶(6kD early secretory antigenic target， Esat-6)，由结核分枝杆菌RD1区Y277片段编码，全长288bp，编码95个氨基酸。 Esat-6在机体产生保护性免疫应答中，通过活化巨噬细胞、树突状细胞、肥 大细胞等释放炎症递质肿瘤坏死因子和组胺等；并参与诱导树突状细胞分 化、成熟并促进γ干扰素介导的Esat6特异性Thl细胞产生的过程。

转基因植物生物反应器是利用基因工程重组技术和植物自生代谢原理 产生具有特殊功能的蛋白，常见的有人或动物的保护性抗原蛋白、抗体和一 些重要的多肽等，它们具有重要药用价值和商业市场。转基因植物生物反应 器和微生物反应器、动物反应器相比较具有生产成本低、表达产物具有天然 的生物活性、安全性好的优点，这也是转基因植物得到迅速发展的重要原因 之一。

启动子是调控外源基因在植物体内表达的开关，它直接影响到外源基因 在植物体内的丰度、表达组织或发育时期，所以，能否选择到适宜受体植物 的启动子使其有较高的表达量，成为转基因植物发展的一个瓶颈问题。

植物表达启动子分为三种：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型 启动子。目前在绝大多数双子叶转基因植物中广泛使用的启动子是来源于花 椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的 Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子等。CaMV35S、Actinl、 Ubiquitin等均为强组成型启动子，控制外源的基因在转基因植株的各个部 位和整个生育期表达。CaMV35S启动子在双子叶植物中的表达效率高于单子 叶植物，而Actinl、Ubiquitin等启动子在单子叶植物中的表达效率较高， 这可能与单、双子叶植物，在转录因子和启动子序列识别上有差异。

选择合适的植物表达启动子，是解决表达量低的有效途径，而选择的依 据主要以受体材料的特性来决定。在植物基因工程研究中，一个表达载体系 统是至关重要的。目前报道植物转基因研究中多采用高效组成型启动子，如 CaMV35S、MMV启动子等，在它们调控下，外源基因在转基因植物中所有的发 育阶段和所有的部位都能表达，这在转抗病基因和抗虫基因时，会收到较好 的效果。但对表达特殊营养成分的基因，例如表达乙肝抗原基因等，外源基 因在植物内持续高效的表达，不仅造成营养成分的浪费，而且往往会造成植 物形态的改变，严重时还会影响到植物的正常发育。

发明内容

本发明的目在于克服现有技术的缺点，提供一种包含结核Esat6抗原基 因的玉米表达载体的构建方法。

本发明的另一目的在于提供上述方法构建的玉米表达载体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种包含了结核Esat6抗原基因 的玉米表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)根据人结核分支杆菌H37Rv株Esat6基因的编码序列设计抗原基 因Esat6的1对引物：

上游引物序列为：P15′GC ACTAGT ATGACAGAGCAGCAGTGGAA-3′，含 SpeI酶切位点和起始密码子ATG；

下游引物序列为：P25′-GC TCTAGA CTATGCGAACATCCCAGTGAC-3′， 含Xba I酶切位点和终止密码子CTA；