[发明专利]一种血管内皮细胞及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种血管内皮细胞及其制备方法与应用。

背景技术

血管内皮细胞不仅参与调节血管通透性和凝血过程，而且在免疫调节、移植排斥、肿瘤转移等许多过程中都具有重要作用。在这些研究应用中，内皮细胞的分离及体外培养是关键。

目前，多从人脐带静脉中分离内皮细胞。但是获得的人脐静脉内皮细胞体外生长能力较差，增殖缓慢，原代培养不易成功，传代培养也只能传3-4代。

内皮细胞的获取多采用机械刮取法和酶消化法。机械刮取法是将脐静脉剪开，用手术刀背等刮取内皮细胞或使用带有尼龙筛的分离管，但这一方法很难掌握力度，易损伤内皮细胞，而且多混有其它细胞如成纤维细胞等。现多采用酶消化法，而选用合理的消化酶并掌握好消化时间，是成功获取内皮细胞的关键之一。胰蛋白酶、胶原酶均可作为消化血管内皮细胞的酶，胶原酶较温和，效果较好。细胞营养液血清的选择也是决定血管内皮细胞是否存活的关键因素。高质量的各种血清才能保证内皮细胞的正常生长。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种分离血管内皮细胞的方法。

本发明所提供的分离血管内皮细胞的方法，是用II型胶原酶消化离体脐带的脐静脉，收集细胞，再进行培养，获得的贴壁细胞即为血管内皮细胞。

其中，所述II型胶原酶与所述离体脐带的配比可以是85U-342U：1cm长脐带，优选为171U：1cm长脐带；所述消化的时间可以为10-30min，优选为10min。

用所述II型胶原酶的溶液进行消化，所述II型胶原酶溶液的初始浓度可以为171U/ml-684U/ml，优选为342U/ml。

所述培养中使用的培养基是向IMDM培养基中添加马血清、胎牛血清、牛血清白蛋白、肝素钠、血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子，使马血清的终浓度为5-15％(体积百分含量)、胎牛血清的终浓度为5-15％(体积百分含量)、牛血清白蛋白的终浓度为0.5-2％(质量百分含量)、肝素钠的终浓度为10-20ug/ml、血管内皮生长因子的终浓度为5-20ng/ml、碱性成纤维生长因子的终浓度为1-5ng/ml，得到的培养基。

所述培养基优选为向IMDM培养基中添加马血清、胎牛血清、牛血清白蛋白、肝素钠、血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子，使马血清的终浓度为10％(体积百分含量)、胎牛血清的终浓度为10％(体积百分含量)、牛血清白蛋白的终浓度为1％(质量百分含量)、肝素钠的终浓度为10ug/ml、血管内皮生长因子的终浓度为10ng/ml、碱性成纤维生长因子的终浓度为1ng/ml，得到的培养基。

其中，IMDM培养基既可以直接从公司购买，也可以自己配制。

IMDM培养基的组成：1L IMDM培养基含17.7g IMDM粉末、终浓度为2mmol/L的L-谷氨酰胺(L-glutamine)和终浓度为25mmol/L的HEPES buffer和3.024gNaHCO₃。

所述培养的条件可以为温度为35-38℃、CO₂浓度为5-8％(体积百分含量)、饱和湿度、培养的时间是3-4天；所述温度优选为37℃，所述CO₂浓度优选为5％。

在每代的培养过程中，从培养开始时计起，培养24h后，换一次新鲜的上述细胞培养基，以及时去掉非贴壁细胞，而留下贴壁的内皮细胞。

所述培养还可包括继代培养。

上述方法中所述脐静脉具体可以为人脐静脉。

用上述任一所述方法获得的血管内皮细胞也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种培养上述细胞的方法。

本发明所提供的细胞培养方法，是在温度为35-38℃、CO₂浓度为5-8％(体积百分含量)、饱和湿度的条件下培养所述细胞，培养所用的培养基可以是向IMDM培养基中添加马血清、胎牛血清、牛血清白蛋白、肝素钠、血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子，使马血清的终浓度为5-15％(体积百分含量)、胎牛血清的终浓度为5-15％(体积百分含量)、牛血清白蛋白的终浓度为0.5-2％(质量百分含量)、肝素钠的终浓度为10-20ug/ml、血管内皮生长因子的终浓度为5-20ng/ml、碱性成纤维生长因子的终浓度为1-5ng/ml，得到的培养基。

培养条件中，所述温度优选为37℃、所述CO₂浓度优选为5％(体积百分含量)。