[发明专利]一种H5亚型禽流感病毒检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种H5亚型禽流感病毒检测试剂盒及其应用。

背景技术

禽流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒。禽流感即由禽流感病毒感染禽类后引起的一种以呼吸系统乃全身性败血症为特征的传染病。2003年12月以来，越南、韩国和日本等亚洲国家先后爆发了大规模的禽流感(均为高致病性禽流感H5N1)，不仅给世界养禽业造成了巨大的经济损失，而且给人类健康和生命安全构成了严重威胁。据世界卫生组织统计截至2007年5月31日全世界人确诊感染禽流感309例，死亡187例。

现有的检测H5亚型禽流感病毒的方法很多，大致可以分为三大类，即病原学诊断方法、血清学诊断方法和分子生物学诊断法。病原学诊断方法包括动物接种试验和细胞培养法，过程复杂、耗时长。血清学诊断方法包括琼脂扩散(AGP)试验、血凝试验、血凝抑制(HI)试验、神经氨酸酶抑制(NI)试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒中和试验(SN)及免疫荧光技术(IF)等，血清学诊断方法的缺点是只能检测动物体内禽流感病毒抗体而无法检测病原。分子生物学诊断方法包括PCR、核酸探针技术等，比前两种方法快速、灵敏，但需要使用特殊的仪器(如PCR仪)，而荧光探针的制备比较昂贵，不适于基层应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的快速检测H5亚型禽流感病毒的检测试剂盒。

本发明提供的H5亚型禽流感病毒检测试剂盒，包括三对引物，一对引物是与禽流感H5N1病毒GenBank Accession Number AY653200中HA基因结合的内侧引物对，一对引物是与禽流感H5N1病毒GenBank Accession Number AY653200中HA基因结合的外侧引物对，一对引物是与禽流感H5N1病毒GenBank Accession NumberAY653200中HA基因结合的环形引物对。因为引物识别的八个区域是通过比对最近几年所有H5亚型的HA基因(包括H5N1至H5N9)得到的保守区，所以引物能识别所有这些H5亚型的HA基因，从而本发明的试剂盒可以用于所有H5亚型的禽流感病毒的检测。本发明提供的H5亚型禽流感病毒检测试剂盒在使用过程中，所述的内侧引物对、外侧引物对和环形引物对作为一个整体组使用，使用时应该尽量避免引物二聚体的形成。

所述内侧引物对包括上游引物(FIP)和下游引物(BIP)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5；所述外侧引物对包括上游引物(F3)和下游引物(B3)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3；所述环形引物对包括上游引物(LF)和下游引物(LB)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。

所述试剂盒还包括环介导等温扩增试剂、阳性对照、阴性对照；所述阳性对照为H5亚型禽流感病毒RNA。

所述环介导等温扩增试剂具体可为含有如下溶质的水溶液：Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、Tween20、MgSO₄、甜菜碱、脱氧核苷酸、Bst DNA聚合酶和AMV反转录酶。

在所述环介导等温扩增试剂中加入所述内侧引物对、所述外侧引物对及所述环形引物对，形成环介导等温扩增反应液；每23μL所述环介导等温扩增反应液中，所述溶质的物质的量如下：

Tris-HCl 0.5μmol、KCl 0.25μmol、(NH₄)₂SO₄0.25μmol、Tween20 0.025μL、MgSO₄ 0.2μmol、甜菜碱20μmol、4种脱氧核苷酸各0.035μmol、Bst DNA聚合酶16U、AMV反转录酶0.2U，所述内侧引物对的上游引物和下游引物各0.04-0.06μmol，所述外侧引物对的上游引物和下游引物各0.004-0.008μmol，所述环形引物对的上游引物和下游引物各0.02-0.04μmol；

每23μL所述环介导等温扩增反应液中，所述溶质的物质的量优选如下：