[发明专利]一种测定奶粉中肽含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及肽检测技术，尤其涉及奶粉中肽含量的测定方法。

背景技术

肽是两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物，是介于大分子蛋白质和氨基酸之间的一种具有生物活性、容易吸收的营养物质。肽以其具有生物活性、利于人体消化吸收等优点广泛应用在乳制品、保健食品等行业。因此，建立准确快速的测定奶粉中肽含量的方法符合行业的发展需求。

蛋白质的分析方法包括光谱法、色谱法和生物化学法等。目前的科学研究中，肽的测定方法是利用高效液相色谱仪来分离检测。蛋白质中常见的氨基酸有20种，每一种氨基酸在肽中的位置又可以不同，因此肽的种类巨大，准确测定其中每一种肽的含量非常复杂。因此高效液相色谱法检测肽含量的方法既不快速，也不实用，不适合应用于实际生产中的质量监控。光谱法具有快速性和方便性的特点。光谱法测定蛋白质含量的方法很多，如：①基于碱性条件下含有肽键的化合物与Cu²⁺形成紫红色络合物的双缩脲法；②基于碱性条件下Folin酚试剂易被蛋白质中的酪氨酸或色氨酸还原成蓝色化合物的Folin酚试剂法(即Lowry法)；③基于酪氨酸或色氨酸在280nm处有吸收高峰的紫外吸收法；④基于肽键在215nm和225nm有特征吸收的紫外吸收法；⑤基于蛋白质与染料结合后发生颜色变化的考马斯亮蓝染色法等。其中方法①和④是建立在肽键的基础之上的，并以双缩脲法比较常用，而且方法④的干扰因素较多。

奶粉中除了肽以外，还含有大分子的蛋白质，二者都含有肽键(-CO-NH-)，都会与双缩脲试剂发生反应而形成紫红色络合物，因此，在采用双缩脲法测定奶粉中肽含量的过程中，必须排除大分子蛋白质对测定结果的影响。

发明内容

本发明的目的在于建立一个操作简便、实用性强的奶粉中肽含量的快速检测方法。上述目的是通过如下技术方案实现的：

一种测定奶粉中肽含量的方法，包括以下步骤：

1)将奶粉溶解于水，在酸性条件下采用加热沉淀法和重金属盐溶液沉淀法沉淀其中的大分子蛋白质，离心去除沉淀；

2)取上清液进行双缩脲反应，然后在540nm检测溶液的吸光度值；

3)配制一系列浓度的肽标准溶液，同样进行双缩脲反应，然后在540nm检测溶液的吸光度值，制作肽浓度-吸光度值的标准曲线；

4)根据吸光度值与肽浓度成正比的规律，通过标准曲线获得步骤2)得到的吸光度值对应的肽浓度，从而计算出奶粉中的肽含量。

上述步骤1)充分考虑了奶粉中大分子蛋白质的特点，乳蛋白中的蛋白质有两类，一类是酪蛋白，另一类是乳清蛋白，前者在酸性条件下沉淀，后者在加热和有重金属盐存在的条件下沉淀，因此，本发明沉淀奶粉中大分子蛋白质的方法是酸性条件下加热并加重金属盐溶液的沉淀法。具体的做法一般是，将奶粉溶解于水，用酸调节pH值至4.0-4.8后先进行加热沉淀，然后冷却至室温，离心去除沉淀，上清液进一步用重金属盐溶液进行沉淀，再次离心去除沉淀。上述加热的温度可为80-120℃，加热时间10-30min。重金属盐溶液沉淀时所用重金属盐的浓度一般在0.1-100g/L的范围内。沉淀物的去除采用离心的方法，即在大于或等于2000r/min的转速下离心5-20min，然后取上清液进行步骤2)的反应。

在步骤1)中，用于调节pH的酸可选自盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、三氯乙酸和磺基水杨酸中的一种或多种。所用的重金属盐可选自乙酸铅、硫酸铅、氯化铅、乙酸铜、硫酸铜、氯化铜、乙酸汞、硫酸汞和氯化汞中的一种或多种。

上述步骤2)进行双缩脲反应采用的双缩脲试剂的配制方法一般是：称取硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)1.5g，酒石酸钾钠5g，用500mL水溶解，再加10％的氢氧化钠300mL，溶解后用水定容至1000mL。

上述步骤3)制作肽浓度-吸光度值标准曲线时，通常是先将含有2-10个氨基酸残基的任意一种肽用酸性水溶液配制成肽浓度为1-5g/L的溶液，然后用酸性水溶液进行梯度稀释，获得一系列浓度的肽标准溶液，分别加入双缩脲试剂进行反应，并于540nm下测定吸光度值OD_540nm。以肽浓度(g/L)为横坐标X，OD_540nm为纵坐标Y，制作标准曲线。其中所述酸性水溶液所含酸的种类及其pH值通常要求与步骤1)相同，pH值一般为4.0-4.8。

上述步骤2)和3)检测吸光度值时使用的空白对照应相同。