[发明专利]蓝舌病病毒抗原的ELISA检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及血清(浆)中蓝舌病病毒(BTV)抗原的双抗夹心ELISA检测方法及试剂盒。

背景技术

蓝舌病(Bluetongue disease，BT)是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起，由库蠓等传播的反刍动物病毒性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为上报动物疫病(OIE Terrestrial animal health code，13th ed.2004.TerrestrialAnimal Health Code.Thirteenth Edition，Office International des Epizooties，Paris.)，在我国被列为一类动物疫病(http://www.ivdc.gov.cn/)。感染动物潜伏期一般为5～12天，病程一般6～14天。反刍动物类感染后平均发病率30～40％，死亡率20～30％，其中绵羊死亡率达80％～90％。

近年来，蓝舌病在世界各地均有暴发。我国于1979年首次在云南宗师发现并分离到BTV，至2000年已有29个省(市)检出羊BTV抗体，近年来牛群中发病也日益严重。此病一旦暴发流行，就很难控制和消灭，因此及时准确地检测出BTV，对预防和控制蓝舌病具有重大意义。蓝舌病病原也是牛/羊源原料或制品病毒安全性检测中必检的主要疫病病原之一，在反刍动物的双边贸易中，各国出入境检验检疫机构规定出口国必须提供无感染此病的健康证明。

研制直接检测血清中BTV抗原的快速、便捷、适合现场使用的检测试剂盒具有很强的实用价值和广阔的应用前景，对BT的防控具有重要意义。

蓝舌病的确切诊断依赖于病毒的分离鉴定或特异性血清学试验，包括琼脂免疫扩散、中和试验、ELISA及分子生物学检测等方法。以单克隆抗体(McAb)为基础的ELISA以其高度的敏感性和特异性，且与相关病毒-鹿流行性出血热病毒(EHDV)均无交叉反应，被国际动物卫生组织(OIE)确定为BTV血清学诊断的首选方法。该方法的快速、经济及高通量，是其它检测方法所无法替代的。

BTV是呼肠孤病毒科环状病毒属的典型病毒。环状病毒共有14个群，BTV群与EHDV群有较强的交叉反应。通过血清中和实验证实，BTV群至少有24个血清型。因此，建立一种可检出BTV群所有血清型的具有群特异性的ELISA检测方法并非易事。1989年曾报道Hussein(Hussein A，Calisher C H，Holbrook F R，et al.1989.Detectionof bluetongue virus antigens in Culicoides variipennis by enzyme immunoassay.J Clin Microbiol，27(6)：1320-1323)等用捕获病毒的ELISA检测库蠓和BHK-21细胞中的BTV，但未见可供使用的商品化ELISA试剂盒。在国内已有许多相关研究，但尚无商品化的BTV检测试剂盒获准上市，国外仅见荧光抗体试剂，但价格昂贵，并且很难获取，而商品化的BTV抗原检测试剂盒和BTV核酸检测试剂盒在国内、外均未见上市。

发明内容

本发明提供了血清(浆)中蓝舌病病毒(BTV)抗原的双抗夹心ELISA检测方法。

本发明所提供的蓝舌病病毒抗原的ELISA检测方法，是用抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体作为包被及酶标抗体的双抗夹心ELISA检测方法。

所述抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体可为一种BTV血清型群特异性抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体。

具体来讲，本发明所提供的检测方法，可包括以下步骤：

1)用抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体包被酶联板，洗板；

2)封闭经包被的酶联板，洗板；

3)加待测样品，洗板；

4)加酶标抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体，洗板；

5)加底物显色；

6)终止反应；

7)测定OD₄₅₀值。

上述检测方法中的反应条件及试剂均可按照常规方法进行选择。

步骤4)中的酶标抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记的抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体。

本发明还提供了一种检测蓝舌病病毒抗原的ELISA试剂盒。

本发明所提供的检测蓝舌病病毒抗原的ELISA试剂盒，可包括作为包被及酶标抗体的抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体。