[发明专利]一种萃取和常压柱层析法纯化微囊藻毒素MCLR的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体地，本发明涉及一种萃取和常压柱层析法纯化 微囊藻毒素MCLR的方法。

背景技术

我国地表水体由于日趋严重的富营养化而加剧了水华的频繁发生。水华发生时， 藻类大量繁殖和腐烂，导致水味腥臭，水体透明度降低，并影响水体中的溶解氧， 造成水生生态严重恶化。某些藻类(如蓝藻)死亡后，由于细胞溶解而释放的藻毒素， 对人类健康造成很大的影响。微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是一类在蓝藻水华污 染中出现频率高、产生量大和造成危害严重的藻毒素，它能够特异性的与蛋白磷酸 酶PP1和2A的丝氨酸/苏氨酸亚基结合，从而抑制它们的活性，促进肿瘤的发生。 鉴于MCs对人体健康的潜在危害，目前国内外针对MCs毒性以及控制对策开展了广 泛的研究。然而高纯度MCs样品的稀有成为制约MCs研究发展的瓶颈，因此需要开 发出简单有效地提纯MCs的方法，以满足对于MCs纯品的需求。微囊藻毒素 LR(Microcystin LR，MCLR)是MCs中毒性最大的一种毒素，极具代表性。

目前，将MCs粗品经过固相萃取等简单净化，再应用不同类型的C18分离柱在 高效液相色谱(HPLC)上根据MCs紫外吸收出峰时间收取对应的流动相是提纯MCs 有效的方法，包括制备型和半制备型液相色谱等。这些方法虽然可以获得较高纯度 的MCs，但仪器和分离柱价格昂贵，在一般的实验室条件下难于实现，而且每次提 纯的MCs量也很少，不能满足批量制备MCs纯品的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种萃取和常压柱层析法提纯MCLR的方法。

根据本发明的方法包括以下步骤：

1)破碎藻细胞：将藻细胞悬液高速离心10～20min，弃去上清液，用超纯水清洗 沉淀，再离心，重复2～4次，得到藻细胞残渣，采用超声或反复冻融等方法进行细胞 破碎；

2)向破碎的藻细胞中加入甲醇，使甲醇的终浓度为40～100％、优选80％，进行 藻毒素的振荡提取，收集提取后的上清液，可以1～3次，合并各次的上清液，在30 ℃下蒸发去除甲醇；

3)对步骤2)得到的水溶液进行液液萃取，以去除部分亲有机相的杂质，抽取 水相，得到MCLR水溶液，重复该步骤4～8次；

4)对步骤3)得到的MCLR水溶液进行C18固相(用100％甲醇活化)萃取， 用0～20％的甲醇洗脱杂质，最后用50～80％甲醇洗脱MCLR，以去除部分极性与 MCLR相差较大的物质，将得到的MCLR洗脱液蒸发至干，并用100％甲醇溶解， 得到MCLR甲醇溶液；

5)将步骤4)得到的MCLR甲醇溶液上样至Sephadex LH-20凝胶层析柱，进 行层析分离，以100％甲醇为流动相，流速为0.5mL/min，收集MCLR活性峰，浓缩 蒸干后溶于超纯水中，得到MCLR水溶液；以及

6)将步骤5)得到的MCLR水溶液上样至DEAE离子交换层析柱(DEAE Sepharose CL-6B离子交换层析柱)，用超纯水进行平衡，再用3mmol/L NaCl溶液洗 脱，流速为1.5mL/min，收集MCLR活性峰，制得MCLR纯品。

根据本发明的方法，在步骤3)中，使用正己烷、二氯甲烷或三氯甲烷、优选正 己烷进行液液萃取，萃取比例为：水相：有机相＝2：1。

根据本发明的方法，在步骤4)中依次使用0％、5％、20％的甲醇洗脱杂质。

本发明提供的萃取和常压柱层析法提纯MCLR的方法，其中使用的液液萃取法 可以有效地实现除色和脱脂。所使用的Sephadex LH-20凝胶是集吸附和分子筛双重 作用于一体的填料，并且可用有机溶剂作流动相，能够去除色度和干扰物。DEAE Sepharose CL-6B是一种弱阴性离子交换材料，容量大，能分离mg级的MCLR，该 材料对离子强度极敏感，只需用低浓度盐溶液即可将MCLR洗脱。大量研究发现， 采用萃取和常压柱层析法提纯MCLR，具有良好的重现性。MCLR的回收率可达 60～85％。

与其他MCs提纯方法相比，本发明提供的方法优点在于，该法具有简便有效、 经济实用、在一般实验条件下即可实现并且相对稳定的特点，能够制备毫克级MCLR 纯品，经HPLC分析，其纯度达85％以上。

附图说明

图1为粗提液液相色谱图。

图2为液液萃取前后MCLR水样扫描图。