[发明专利]重组海参溶菌酶的生产方法及由其制得的重组海参溶菌酶

权利要求书

1.一种重组海参溶菌酶的生产方法，其特征在于该方法是将如SEQ ID NO.1 所示的海参溶菌酶基因连接到真核表达载体pPIC9K中构建重组质粒，并将所形 成的重组质粒转化到毕赤酵母SMD1168中，经甲醇诱导表达，然后经阳离子交 换树脂层析柱纯化后得到重组溶菌酶，具体包括如下步骤：

①获取海参溶菌酶基因，包括从海参肠组织中提取总RNA，并通过反转录 扩增海参溶菌酶的cDNA保守区域、扩增海参溶菌酶基因cDNA片段5′末端及 3′末端的步骤，其中：

扩增海参溶菌酶的cDNA保守区域的反转录过程所使用的简并引物为：

HS1-1       5′-ATGGA(CT)GT(GC)GG(CAT)TC(AT)CT(AG)TCGTGTG-3′

HS1-2       5′-GCCGTTGTG(TAG)ATACGGGCAAA(AG)TC-3′

扩增海参溶菌酶基因cDNA片段5′末端，所使用的带磷酸标记的反转录引 物RT-Primer和两对巢式PCR引物序列如下：

RT-Primer   5′--(P)TACGGGCAAAATCC--3′

HS1-S1      5′--ACCTTTGACTGCGGTGAAC--3′

HS1-S2      5′--GCAACCTATGCCCGTCTA--3′

HS1-A1      5′--CCATCCAGACTACCTCCCTT--3′

HS1-A2      5′--GCATCCTGCCAGTAGCCT--3′

扩增海参溶菌酶基因cDNA 3′末端，所使用的引物为：

HS1-GSP 1′ 5′--GGATGTGGGTTCTCTATCGTGTG--3′

HS1-GSP2    5′--TAGGCTGAAGGGAGGTAGTCTGG--3′

②重组质粒的构建：通过PCR、酶切将步骤①获得的如SEQ ID NO.1所示 的溶菌酶基因连接到真核表达载体pPIC9K中，其中PCR使用特异性引物HS1-7 和HS1-8，引物两端分别引入EcoR I和Not I限制性酶切位点：

HS 1-7     5’----GCAGAATTCATGCAAGTTCCTTCTGATTGC----3’

HS 1-8     5’----AAGTTTGCGGCCGCTCAGTTGTTGCTCAT----3’

PCR循环参数为：50℃ 30min，94℃ 2min；94℃ 30s，40℃ 30s，72℃ 1.5min，5个循环；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；最后72 ℃延伸10min；

回收PCR扩增产物，用EcoR I和Not I酶切，然后与经同样酶酶切的酵母 表达载体pPIC9K相连接形成重组质粒；

③重组质粒的转化及重组菌株的筛选：将重组质粒DNA用Bgl II酶解， 用电击法将质粒DNA转化至酵母菌SMD1168中，并涂布于MD固体培养板上， 30℃培养2～3天；将长出的菌落转至含有4mg/ml G418的YPD固体培养基上 进行进一步筛选，将选出的高拷贝转化菌株接种至混有溶壁微球菌的BMMY固 体培养基中，30℃培养6～7天，观察不同菌株对溶壁微球菌的抑菌活性，筛选 高活性的重组菌株；

④重组菌株的甲醇诱导表达及重组溶菌酶的纯化：将步骤③筛选得到的重 组毕赤酵母SMD1168先在BMGY液体培养基中，30℃摇瓶培养，250转/分钟； 当OD值达到9.0±0.5时，更换培养基，用原培养物10％体积的BMMY培养基， 继续培养；每24h添加甲醇，保持甲醇浓度0.5％(v/v)，4天后结束培养，离 心收集培养液上清；将该培养液上清透析去离子，再经过CM-Sephrose FF阳离 子交换树脂层析柱，用0.05M pH8.0 Tris-HCl连续洗脱，留取活性峰液，再透 析去离子，然后将透析过的洗脱液在冻干机上冻干，得到重组溶菌酶干粉。