[发明专利]重组海参溶菌酶的生产方法及由其制得的重组海参溶菌酶

说明书

技术领域

本发明涉及利用生物技术生产重组海参溶菌酶的方法，属于分子生物学制 药技术领域。本发明还涉及利用该方法生产出来的重组海参溶菌酶。

背景技术

溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性酶，它能催化细菌细胞壁中粘多糖N-乙 酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4糖苷键的水解，导致细胞裂解，内容 物逸出而使细菌死亡。它广泛存在于自然界动植物和微生物的组织、体液及分 泌物中，在生物机体的免疫防御系统中发挥重要作用。对于缺少特异性免疫的 无脊椎动物而言，抗菌效应尤为重要，而无脊椎动物组织中分布最广泛的抗菌 蛋白即是溶菌酶。不仅如此，溶菌酶还作为无脊椎动物的一种重要的消化酶， 通过分解微生物来获得生长所需的部分C、N源。

溶菌酶作为天然的抗菌剂、免疫增强剂和防腐剂目前广泛应用于医药、食 品及饲料等行业。近年来随着海洋生物鱼类、虾类、贝类以及海珍品，如海参、 鲍鱼等养殖产量的快速增长，随之而来的是海水养殖生产中的品质退化、养殖 水平低、疾病泛滥及环境污染等问题。目前在水产品养殖以及畜禽生产中使用 抗生素带来的问题也越来越受到人们的关注，一是耐药性问题，二是药物残留 问题，其副作用是不可忽视的，人们不希望以牺牲人类健康为代价换取海产品、 畜禽产品生产性能的提高。因此，采用该基因工程菌生产的溶菌酶是一种天然 无毒的酶制品，它对大部分水生动物和畜禽动物即是体内自身的免疫因子，又 可作为养殖生产中的抑菌剂，降解和杀死常见的致病菌。所以，该溶菌酶可以 代替抗生素应用于养殖生产中，可以取得安全、品质好、功效高的海产品和畜 禽产品。

目前溶菌酶主要从蛋清中提取，由于来源有限，生产工艺复杂，溶菌酶产 量十分有限，价格居高不下，难以满足越来越大的市场需求。因此用基因工程 手段表达溶菌酶成为很重要的手段。前期的研究者利用RT-PCR和RACE PCR 技术，从海参(Stichopusjaponicus)体壁中克隆得到一种溶菌酶基因(GenBank： EF036468)；并通过生物信息软件分析得到关于其编码产物的结构特点信息(“海 参i型溶菌酶基因及其编码产物的结构特点”，中国生物化学与分子生物学报， 2007年7月，23(7)：542～547)。

发明内容

本发明在上述研究结果的基础上，提供一种利用生物技术生产重组海参溶 菌酶的方法。

本发明提供一种重组海参溶菌酶的生产方法，是将海参溶菌酶基因(SEQ ID NO.1)连接到真核表达载体pPIC9K中构建重组质粒，并将所形成的重组质粒 转化到毕赤酵母SMD1168中，经甲醇诱导表达，然后经阳离子交换树脂层析柱 纯化后得到重组溶菌酶。

上述方法中所述的海参溶菌酶基因(SEQ ID NO.1)是通过从海参肠组织中 提取RNA，再通过反转录获得。具体做法是：

①从本地新鲜海参中取出海参肠组织，提取总RAN，并通过反转录扩增海 参溶菌酶的cDNA保守区域，反转录所使用的简并引物为：

HS 1-15′-ATGGA(CT)GT(GC)GG(CAT)TC(AT)CT(AG)TCGTGTG-3′

HS 1-25′-GCCGTTGTG(TAG)ATACGGGCAAA(AG)TC-3′

②扩增海参溶菌酶蛋白基因cDNA片段5′末端，所使用的反转录引物 RT-Primer(带磷酸标记)和两对巢式PCR引物序列如下：

RT-Primer 5′--(P)TACGGGCAAAATCC--3′

HS1-S1    5′--ACCTTTGACTGCGGTGAAC--3′

HS1-S2    5′--GCAACCTATGCCCGTCTA--3′

HS1-A1    5′--CCATCCAGACTACCTCCCTT--3′

HS1-A2    5′--GCATCCTGCCAGTAGCCT--3′

③扩增海参溶菌酶蛋白基因cDNA 3′末端，所使用的引物序列如下：

HS1-GSP1    5′--GGATGTGGGTTCTCTATCGTGTG--3′

HS1-GSP2    5′--TAGGCTGAAGGGAGGTAGTCTGG--3′