[发明专利]林蛙抗癌肽及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于抗癌药物及其制备领域，特别涉及一种具有抗癌活性的林蛙抗 癌肽药物及其制备方法。

背景技术

林蛙(Rana chensinensis)是我国东北地区长白山麓药、食两用的珍贵蛙种。 林蛙是两栖类动物，生存环境复杂多样，它们的皮肤在维持它们生存和适应广 阔栖息地中起着重要作用，为了适应存环境，蛙类的皮肤中分布了种类繁多、 具有特殊分子结构、功能复杂的生物活性物质，是一个巨大的生物活性分子资 源库和药物资源库。

目前，国内对林蛙干皮抗菌肽进行了研究，申报的专利也在增多，其中 CN1216768A“生物抗菌肽及其制备方法”是涉及一种具有广谱抗菌活性的林蛙 蛙皮生物抗菌肽及其制备方法；CN1583166A“林蛙抗菌肽喷雾剂及其制备方 法”、CN1583165A“林蛙抗菌肽凝胶剂及其制备方法”是涉及保护林蛙皮肤 抗菌肽以喷雾剂和凝胶剂两种形式用于临床皮肤感染、烧伤烫伤感染领域； CN1679632A“林蛙镇痛水提物及其制备方法及”是关于保护从林蛙干皮中提取 的一种具有镇痛作用的林蛙镇痛水提物及其制备技术。

发明内容

本发明的目的针对现有抗癌药物的不足，提供一种林蛙抗癌肽及其制备方 法，该抗癌肽具有用量少，对多种癌细胞有较强杀伤力，不损伤正常细胞等优 点。

本发明的林蛙抗癌肽具有如下特征：

以林蛙皮肤为原料于pH3-5酸化乙醇中浸提，将提取液离心后得上清液， 上清液冻干浓缩，溶于蒸馏水中配制成溶液，经凝胶柱层析，1-3M醋酸为洗脱 液，280nm检测波长下，分离得到分子量为1-10kD具有抗癌活性的肽，冻干浓 缩为白色粉末，其在pH 3-10范围内具有活性，pH值为5时活性最强，于0～ 10℃保存24个月仍有活性。

本发明涉及的林蛙抗癌肽以林蛙皮为原料，其制备方法如下：

1、将林蛙皮加入2-10倍体积的酸化乙醇，于4-20℃浸提24-72小时。其中 酸化乙醇为0.5-5M盐酸与乙醇调至pH值4-5或0.5-5M醋酸与乙醇调至pH值 3-4为宜；

2、上述提取液在3000-8000rpm下离心10-60min，收集上清液；

3、沉淀重复2-3次步骤1和2；

4、合并上清液冻干浓缩；

5、冻干粉溶于蒸馏水中配成溶液；

6、上述溶液经Sephadex G-50凝胶柱层析，4-10℃条件下层析分离。凝胶 柱以1-3M醋酸平衡，上样，1-3M醋酸洗脱，流速为0.1-0.6ml/min，收集洗脱 液，每8min收集一管。根据检测器测得的280nm下的紫外吸收峰合并各组分， 收集分子量为1-10kD的活性组分，见图1；

凝胶柱还可以为Sephadex G-25或Sephadex G-75。

7、活性组分透析脱盐，冷冻干燥；于-20℃保存，得到本发明的林蛙抗癌肽。

本发明林蛙抗癌肽，体内和体外的抗癌作用研究表明林蛙抗癌肽对S₁₈₀胃 肉瘤、白血病K562细胞、乳腺癌MCF·7细胞、卵巢癌SKOV3细胞、宫颈癌 Hela细胞、肝癌HepG₂细胞和肝癌7721细胞均有明显的抑制生长作用；并能诱 导K562肿瘤细胞发生凋亡，细胞膜破损、细胞变形或出现胞芽和缢痕，细胞皱 缩变小，胞浆致密，核固缩，染色质浓集、边聚化，胞质空泡化等。

本发明所述的林蛙抗癌肽，其主要用于制备抗癌药物或保健食品。

附图说明

图1林蛙抗癌肽Sephadex G-50柱层析图

图2对照组K562细胞；图3丝裂霉素作用的K562细胞

图4林蛙抗癌肽作用的K562细胞

图5林蛙抗癌肽作用K562细胞24h、48h、72h后DNA电泳

具体实施方式

下面实施例进一步说明本发明的制备方法，并不是用来限制发明的范围。

实施例1

1、将100g林蛙皮加入1000mL酸化乙醇(乙醇与0.5M盐酸配至pH值为4) 于4℃浸提24小时；

2、提取液在3000rpm离心80min，收集上清液，沉淀；

3、沉淀再加入1000mL酸化乙醇，于4℃浸提24小时；

4、提取液在3000rpm离心10min，收集上清液，沉淀弃去；