[发明专利]一种高效基因克隆方法

说明书

技术领域：

本发明是一种高效的基因克隆方法，适合于扩增基因组DNA和PCR产物，属于基因工程与分子生物学领域。

背景技术：

基因克隆技术是在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入宿主细胞获得大量拷贝的过程，基本步骤为，制备目的DNA片段，用DNA连接酶连接DNA片段和载体，制成DNA重组体，将DNA重组体导入宿主细胞，筛选、鉴定。

目前，细菌基因组文库构建与真核、原核基因筛选等经常使用粘性末端克隆，T-末端克隆，平末端克隆等克隆方法。任海霞，王三英在《WP2深海细菌基因组文库的构建和克隆子测序比对分析》中报道了一种以BamH l酶切的pUC19为载体，通过与限制性内切酶Sau3A I酶切的WP2深海细菌DNA片段连接，电击转化感受态细胞E.coli DH5α的文库构建方法，该方法为粘性末端克隆。中国专利：一种基因克隆的高效方法。授权公告号(CN 118526C)公布了一种利用粘性末端克隆基因的方法。但是，粘性末端克隆法连接效率相对较低，同时必须向目的DNA片段引入酶切位点，造成了步骤上的相对繁琐。同时，载体的去磷酸化效率难以保证，稳定性不高。平末端连接法连接效率更差，只能用于单个基因克隆，很少用于基因文库构建。

目前，最为方便快捷的DNA克隆方法为A-T克隆法。市场上销售的T载体试剂盒主要是pUC18(pUC19)的衍生载体，即在pUC18(pUC19)的基础上通过添加限制性酶切序列后，经过不同生物酶修饰后得到的可以进行A-T克隆的载体，如TAKARA(Japan)在其A-T克隆载体使用说明书中公布的：在pUC18(pUC19)的多克隆位点中引入EcoR V酶切位点后，利用限制性内切酶EcoR V进行完全酶切，再利用末端转移酶在两侧的3’端加T产生。

发明内容：

本发明的目的是应用生物化学，分子生物学技术，提供一种能够简便，高效克隆细菌基因组DNA，PCR产物的方法，以解决基因克隆中繁琐程序。

本发明是这样实现的，选择pUC18(pUC19)质粒作为载体，采用Sal I酶切完全酶切产生5’端突出3个碱基的粘性末端

5’     ATGCCTGCAGG        3’

3’     TACGGACGTCCAGCT    5’

载体完全酶切后用Klenow酶补加碱基T、C、G，使载体片段末端5’端突出碱基T

5’     ATGCCTGCAGGTCG     3’

3’     TACGGACGTCCAGCT    5’

细菌基因组DNA采用限制性内切酶酶切或超声波酶切方法，断裂成DNA片段长度小于10kb的片段。细菌基因组DNA片段，PCR产物用Taq酶补平并在3’端加碱基A。

用上述方法修饰过的载体与DNA片段(PCR产物)通过A-T碱基末端互补而连接起来，经过转化大肠杆菌后蓝白斑互补筛选克隆基因。

本发明的原理是利用碱基互补配对的原则，使克隆载体与DNA片段产生能相互匹配的碱基末端，进行A-T克隆，极大地提高了克隆效率，同时进行蓝白斑筛选，便于基因的筛选。

具体实施方式：

实施例一  细菌基因组文库构建

(1)将小麦叶片浸入含0.05％吐温20的灭菌水中，摇床振荡30分钟，中间取出摇晃均匀。

(2)把含上述微生物的洗脱液10倍梯度无菌水稀释，不同稀释度分别在LB固体培养基上(1％蛋白胨，0.05％酵母膏，0.05％Nacl，1.5％琼脂粉)30℃下培养48小时，挑取单菌落并在LB固体培养基上划线分离纯化三次。

(3)分别挑取单菌落在LB液体培养基上(1％蛋白胨，0.05％酵母膏，0.05％Nacl)30℃下，于恒温振荡器上200转/分钟培养24小时，8000转/分钟收集菌体，采用上海生工生产的基因组DNA提取试剂盒(货号：SK120101)提取各自的基因组。

(4)将细菌基因组DNA利用Sau3A I酶切，酶切完全后补平并在DNA3’末端加上碱基A，50μl体系构成为1×PCR buffer，2.5mM MgCl2，200μM of each dNTP，2.5 units of TaKaRa Taq DNApolymerase and 10ng genomic DNA，反应条件为72℃ 10min。