[发明专利]HCV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种HCV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒，包括

-PCR管为聚苯乙烯材料制成的普通PCR管，其上包被捕捉获得性人类 免疫缺陷病HCV病毒靶分子的抗体或配基；

-检测试剂A液和B液，用于获得性人类免疫缺陷病HCV病毒配体/抗 原检测；

A液由100ul、pH值为7.4的25pmol/ul带有人为序列修饰的检测配基和 2ug/ml抗体的磷酸盐缓冲液组成；所述人为序列修饰的检测配基是指人为在 配基的3’和5’端分别或同时加上已知序列的单链茎环结构和两条互补双链；

B液由1ul上游引物、1ul下游引物、8ul 4×dNTP、10ul 10×PCR缓冲 液、2～5单位的耐热DNA聚合酶和水组成；其中上游引物序列为1：5’ -TCTAACGTGAATGATAG-3’；下游引物序列为2：5’ -TATGGTCGAATAAGTTAA-3’；

-标准检测样品；

-阴性和阳性对照样品。

2.如权利要求1所述的一种HCV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒， 其特征在于：所述B液还含有分子信标。

3.如权利要求2所述的一种HCV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒， 其特征在于：所述的分子信标是修饰序列的茎环分子信标、SYBR Green 1荧 光染料及带有荧光分子和淬灭分子的探针分子信标中的任意一种。

4.一种制备如权利要求1所述的HCV病毒抗原及配体管式PCR检测试 剂盒的方法，包括以下步骤：

(1)在37±1℃下、用体积浓度为1～20％的戊二醛处理PCR管，使戊二醛 附着在PCR管；

(2)用超纯水清洗PCR管；

(3)将捕捉HCV靶分子的配基/抗体包被在PCR管上；

(4)用pH值为7.4的含5％的脱脂奶粉、甘氨酸、牛血清白蛋白和龟精DNA 的碳酸氢钠缓冲液封闭PCR管，经干燥得PCR管；

(5)配制检测试剂A液：A液由100ul、pH值为7.4的25pmol/ul带有人 为序列修饰的检测配基和2ug/ml抗体的磷酸盐缓冲液组成；所述人为序列修 饰的检测配基是指人为在配基的3’和5’端分别或同时加上已知序列的单链 茎环结构和两条互补双链；

将检测HCV病毒的抗体和经序列修饰的抗体特异寡核苷酸配基在pH值 为7.4的磷酸盐缓冲液中孵育并通过紫外线交联，或用磷酸盐缓冲液溶解配 基即可；

(6)配制检测试剂B液：B液由1ul上游引物、1ul下游引物、8ul 4×dNTP、 10ul 10×PCR缓冲液、2～5单位的耐热DNA聚合酶和水组成；其中上游引 物序列为1：5’-TCTAACGTGAATGATAG-3’；下游引物序列为2：5’ -TATGGTCGAATAAGTTAA-3’；

将B液各组分混合后加水即得；

(7)将干燥后的PCR管、检测试剂A液和B液与标准检测样品、阴性和 阳性对照样品组装，放入试剂盒即可。

5.如权利要求4所述的制备HCV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒 的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的配基包被在PCR管上是指先将链酶亲 和素包被在PCR管上，再加入带有生物素的配体捕捉配基，通过链酶亲和素 和生物素的结合，使捕捉配基固着在PCR管上。

6.如权利要求4所述的制备HCV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒 的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的抗体包被在PCR管上是指将单克隆抗 体用pH值为9.6的碳酸氢钠缓冲液包被在PCR管上。