[发明专利]HCV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种HCV病毒抗原及配体管式 PCR检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

早期蛋白质检测是以抗体同特定待检物蛋白质的低解离常数和一定的特 异性为基础，采用简易方便的筛选方法——抗体捕捉法。该法是检测样品中 有无抗原：首先将抗原包被于固相支持物，然后用抗体去结合抗原形成复合 物，冲洗去掉未结合的抗体，最后用和结合抗体特异识别的标记分子去检测 结合抗体；也可以抗原、抗体先反应形成复合物后，再结合到固相支持物上， 然后检测复合物。许多抗体捕捉法是利用间接法来检测抗体，如检测抗体是 鼠抗体，则检测分子可能是带检测标记的兔抗鼠抗体，所用的传统检测标记 包括放射性同位素、染料和作用于底物产生可检测分子如色原的酶。

酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是广为 人知的免疫检测法，传统的ELISA技术似三明治夹心法，即两抗体共同结合 到某一抗原——捕捉抗体，将其同样品中的抗原结合，再加入同抗原结合的 偶连酶的检测抗体，然后反应形成捕捉抗体—抗原—检测抗体“三明治”复 合物，最后测偶连酶活性显示检测结果。虽然抗体检测法具有较大的应用价 值，但是它的检测范围受捕捉抗体和抗原反应的解离常数(Kd)值限制。在 实践中，检测低限大约是Kd值的1％，当待分析物浓度降低到这个可能检测 极限时，所捕捉到的待分析物抗体百分率将不足以产生相对于信噪比的可检 测信号。因此，用荧光或化学发光检测系的抗体检测法的检测下限约1pg/ml (10-4M对平均分子量50,000道尔顿的蛋白质)。

随着基因技术应用的快速发展，在抗原抗体检测方面已有较多的基因检 测技术。

核酸待测物的检测要求不同于抗体检测的技术。在二十世纪八十年代中 期，DNA技术的研究发现了通过酶重复扩增过程可扩增DNA的方法，后来 叫聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)：首先加入两互补的寡核 苷酸序列(叫引物)，它将结合在所要扩增的区域的两侧，然后加热变性，在 降温退火过程中让引物同互补序列结合，再加入Klenow片段DNA聚合酶I 以延伸引物，通过重复变性、退火、延伸所希望的片段，目标DNA就会以指 数方式扩增。PCR曾经过许多改进，一个重要的变化是耐热聚合酶(即Taq 聚合酶)的应用，它产于温泉中嗜热菌，具有热稳定性，几乎不被PCR变性 中高温影响，所以不必像应用不耐热的Klenow聚合酶I，每一次变性后得补 加聚合酶。

在以PCR作为扩增系统的运用中，产生了免疫-PCR方法。该法是把特 定待测物连接到微孔板上，然后用PCR扩增放大能力来检测——例如小牛血 清白蛋白(BSA)被动吸附到一免疫检测板上，加入对BSA的特异抗体(连 有蛋白A链亲和素融合蛋白及生物素标记的报告扩增子)，PCR后用琼脂糖 电泳分析报告扩增子，可检测到几百个BSA分子，但这种方法不能实现定量 检测，同时因为缺乏待测物的特异捕捉分子，也不能用于生物样品检测。为 此，人们不断对其进行改进：首先用生物素化第二抗体和一个连接生物素化 报告扩增子的链亲和素融合蛋白，然而5种试剂的加入、洗板、扩增、检测 很费时费力，而且解离复杂；随后又把报告扩增子共价连到第二抗体上，虽 然直接连接减少了试剂数目和解离复杂性，但仍需要PCR操作，劳动强度和 试验室污染的可能性还是无法降低。

三明治式免疫-PCR是由传统ELISA方式的改编而来，即检测抗体连有 DNA标记，再运用到分析检测生物样品。早期的抗体免疫-PCR检测形式是 将初级抗体固定在平板上，然后依次加入样品，再用生物素化检测抗体，链 亲和素和生物素化的DNA；后来改进为直接连接DNA到抗体上和用标记引 物产生PCR产物，而PCR的扩增能力可产生大量DNA标记，这种DNA标 记可用典型的凝胶电泳检测分析。PCR扩增抗体携带的DNA标记可提高对 抗原检测的灵敏度(该法缺少用基因芯片法来检测)，比传统ELISA方法的 灵敏度还高，但用凝胶电泳纯化扩增产物需要大量人工操作，因此耗时；而 且用于PCR扩增的引物在退火时可引起二聚体扩增产生副产品；同时它还存 在污染核糖或污染也将同样被扩增的情况。