[发明专利]一种通过NOS3基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测用的试剂盒，具体涉及一种通过NOS3基因拷贝数预测高肺水肿发病风险的试剂盒，用于评定人体高原肺水肿的易感性。

背景技术

高原肺水肿(high altitude pulmonary edema，缩写HAPE)是一种特发于高原低氧环境的肺水肿，起病急，进展快，危害大，如果救治不及时，可在较短的时间内发展至呼吸衰竭，甚至死亡，是严重威胁进入高原人群健康和生命的急性重症高原病。近年的调查表明，在从平原进入海拔3000米以上高原的汉族人群中，高原肺水肿的发病率高达0.4％-2％。高原肺水肿发病有明显的家族和个体易感倾向，环境因素和遗传因素均可以影响高原肺水肿的发生。近年来，遗传因素在高原肺水肿发病机制中的作用逐渐受到重视【张雪峰，高原施工人群急性重型高原病患病率调查，《高原医学杂志》，2005；15(3)：7-8；陈有，高原肺水肿发病机制研究进展，《高原医学杂志》，2005，15(2)：62-64；高钰琪，高原肺水肿的发病机制及防治，《人民军医》，2005；482(2)：108-111】。

目前，认为高原肺水肿发生的基本机制有：肺动脉压过度升高；肺毛细血管通透性增强；肺泡上皮堆水清除障碍；血浆胶体渗透压降低。其中肺动脉压过度升高是高原肺水肿发病的中心环节。NO(一氧化氮)具有血管扩张作用，能迅速降低缺氧造成的肺动脉高压，降低高原肺水肿的发生。一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，缩写为NOS3)是NO生成过程中最主要的限速因子， 是NO合成的关键酶。Ahsan A等报道NOS3的单核苷酸多态性与高原肺水肿的发生密切相关，【Ahsan A，eNOS allelic variants at the same locus associatewith HAPE and adaptation，《Thorax》，2004；59(11)：1000-1002】。目前有文献报道，一些基因的拷贝数与疾病的易感性相关，是一些疾病的遗传标记【Braude I，Largesca lecopy number variation(CNV)at 14q12 isassociated with the presence of genomic abnormalities in neoplasia，《BMC Genomics》，20067：138.】，关于NOS3拷贝数与高原肺水肿易感的相关性尚无报道。

通过SYBR(即SYBR GREEN染料，缩写SYBR)定量PCR(聚合酶链反应)的方法检测NOS3拷贝数，发现NOS3拷贝数与高原肺水肿易感性之间存在相关性。具体做法是：

(1)健康对照组标本(25例)：在成都采集拟进入高原人员静脉血2ml(EDTA抗凝)，然后与他们一起乘飞机达到拉萨(海拔3658米)，并观察他们在拉萨一周内没有发生高原肺水肿；

(2)高原肺水肿病例组标本(25例)：为与健康对照组标本年龄匹配，按高原病诊断标准【我国高原病命名、分型及诊断标准，《高原医学杂志》，1996：2-4】符合高原肺水肿诊断标准的病例。样本收集过程中遵循“赫尔辛基”宣言，本研究得到了收集对象的知情同意，采集静脉血2ml(EDTA抗凝)。

(3)分别用上海生工生物技术服务有限公司UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒(货号SK1342)提取健康对照组标本和高原肺水肿病例组标本血液白细胞DNA，然后采用定量PCR(SYBR染料法)的方法分别扩增健康对照组标本和高原肺水肿病例组标本的NOS3基因和核基因编码的看家基因Beta-actin；再 分别计算每例标本的NOS3拷贝数与Beta-actin的拷贝数的比值，结果经SPSS12.0(一种统计软件)中的独立样本T检验进行检验，以P<0.05为相差显著，并通过该软件计算95％的可信区间，以分别得到健康对照组和高原肺水肿病例组NOS3/Beta-actin拷贝数的参考值，结果发现在高原肺水肿病例组中NOS3/Beta-actin的拷贝数比值显著升高(表1)。

表1　高原肺水肿病例组和健康对照组中NOS3/Beta-actin拷贝数比值