[发明专利]一种细菌阿魏酸脱羧酶基因及其晶体结构

说明书

技术领域：

本发明涉及一种细菌阿魏酸脱羧酶基因及其晶体结构，属分子生物学和应用微生物学技术领域。

背景技术：

阿魏酸(4-羟基-3甲氧基-2-丙烯酸)是一种广泛存在植物界的羟基肉桂酸，是麦麸中含量最高的酚酸，可达其干重0.5～1％。它主要通过酯键与多糖和木质素交联，或自身酯化或醚化形成二阿魏酸。许多植物、真菌、细菌、放线菌、微藻等能将阿魏酸分解生成香兰素，阿魏酸作为生物转化生产香兰素的前体物质，具有易得、价廉以及对微生物的毒性较小等优点，因此对以阿魏酸为前体物质转化生成香兰素的代谢途径的研究具有很大的理论意义和生产价值。

香兰素(4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)，又名香草醛，是一种重要的广谱型香料之一，香气幽雅、爽快，可直接应用于化妆品、香烟、糕点、糖果以及烘烤食品等行业，也可用作植物生长促进剂、杀菌剂、润滑油消泡剂等。香兰素是重要的有机合成中间体，在国内香兰素主要应用于食品添加剂，近几年来在医药领域的应用被不断拓宽，已成为香兰素最有发展潜力的应用领域。除此外，它还可在电镀工业中用作上光剂，农业中用作催熟剂等。

在阿魏酸代谢生成香兰素的途径中，阿魏酸脱羧酶催化阿魏酸生成4-乙基愈创木酚，是阿魏酸代谢形成香兰素的关键酶。另外4-乙烯基愈创木酚作为一种感觉阈值极低的物质，能产生一种特别的酚类物质的香气。这种物质能提高食品的感官品质，对酒、食品，饮料的自然香气也有很大影响。

以往对以阿魏酸为底物转化形成香兰素的研究主要集中于代谢途径方面，目前一些主要的代谢途径已经逐渐的被报道。然而参与细菌Enterobacter sp.Px6-4催化阿魏酸形成4-乙基愈创木酚的脱羧酶的基因还没有被报道。为了更加深入的了解Enterobacter sp.Px6-4中阿魏酸脱羧酶的结构与功能之间的关系，本发明通过基因克隆、表达和悬滴扩散结晶方法获得了阿魏酸脱羧酶的晶体，并通过X-衍射方法对阿魏酸脱羧酶的晶体结构进行了解析。经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。

发明内容：

本发明从能够转化阿魏酸形成4-乙基愈创木酚和香兰素的细菌Enterobacter sp.Px6-4中克隆得到阿魏酸脱羧酶的编码基因。该菌株已经保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国，北京中关村；保藏日期：2007年4月12日；保藏号：CGMCC No.1999。

本发明的目的是通过基因克隆的方法扩增得到细菌Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脱羧酶的编码基因，在大肠杆菌E.coli中表达，并运用悬滴扩散法得到阿魏酸脱羧酶的蛋白质结晶，并通过X-衍射方法对该酶的结构及活性中心进行了解析。为进一步研究阿魏酸脱羧酶的结构和功能之间的关系以及改变4-乙烯基愈创木酚产量提供理论上的指导。

1.本发明中从细菌Enterobacter sp.Px6-4中克隆得到阿魏酸脱羧酶的编码基因，并在大肠杆菌E.coli中成功表达的方法包括如下步骤：

1)本发明根据GenBank(国际核苷酸序列数据库，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上报道的6条细菌来源的羟基肉桂酸脱羧酶的基因序列(AF017117，AJ276891，AJ27863，AJ492219，U63827 and X84815)设计了一对简并引物PS和Px2(表1)用于扩增阿魏酸脱羧酶的保守序列。

2)依据该保守片段设计了6条特异性引物PxT31，PxT32，PxT33，PxT51，PxT52，PxT53(表1)，并应用DNA Walking SpeedUp^TM Premix试剂盒扩增得到Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脱羧酶保守序列两端的未知序列。

3)通过DNAman生物学软件进行拼接获得Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脱羧酶的全长编码基因序列(详见阿魏酸脱羧酶基因序列表)。

4)依据Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脱羧酶的全长编码基因序列设计了特异性Px1e和Px2e(表1)用于扩增Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脱羧酶编码序列。

表1.本发明所用到的引物序列

5)将PCR产物用EcoR I和Hind III进行双酶切，回收纯化酶切后的小片段并与经EcoR I和Hind III双酶切后的pET-28a连接，构建表达载体。

6)将构建好的表达载体转化E.coli BL21；经IPTG诱导后，E.coli BL21大量表达有活性的阿魏酸脱羧酶。