[发明专利]溴氰菊酯抗原、抗体及其应用

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种溴氰菊酯抗原、抗体及其应用，属于免疫化学分析技术领域，专用于溴氰菊酯特异性抗体的制备及酶联免疫检测方法。

二、背景技术

溴氰菊酯(deltamethrin)是1974年ELLIOT等人开发的合成拟除虫菊酯类杀虫剂，商品名敌杀死，化学名称及结构见下图，纯品为白色斜方形针状结晶，mp：101～102℃，微溶于水，能溶于大多数有机溶剂，在酸性条件下稳定。具有胃毒和触杀作用，击倒快，并有拒避活性。对鳞翅目幼虫特别有效，是当代最高效的拟除虫菊酯类杀虫剂之一。

目前对溴氰菊酯的残留分析主要是气相色谱法，该方法检测费用高，不适合进行批量样品的快速检测。而农药残留免疫分析技术是免疫分析应用于农药残留分析领域的一门新技术，以其简单、快速、廉价，特别适用大批量样品检测等优点得到了全面迅速发展，美国化学会(AOAC)已将免疫分析与气相色谱、液相色谱同列为农药残留检测的三大支柱技术。但到目前为止，溴氰菊酯的免疫分析方法，国内未见报道，国外有报道，但与本发明合成的半抗原结构和方法不同。

溴氰菊酯的结构

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种溴氰菊酯特异性抗体的制备及酶联免疫分析方法。

技术方案

溴氰菊酯人工半抗原的分子结构式为：

1-羧基-(3′-苯氧基苯基)甲基-3-(2′，2′-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基羧酸酯Med

或

N-2-(羧基丙基)氨甲酰基-(3′-苯氧基苯基)甲基-3-(2′，2′-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基羧酸酯Di

人工半抗原1-羧基-(3′-苯氧基苯基)甲基-3-(2′，2′-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基羧酸酯Med的制备步骤如下：

1)取0.5～5g氰醇于100mL三口烧瓶中，加入5～15mL浓盐酸，50～70℃磁力搅拌反应2h；

2)反应后的混合液用乙醚萃取；

3)乙醚层再用水洗，上层过无水Na₂SO₄，浓缩近干，得氰酸的粗产物；

4)柱层析法纯化，石油醚湿法装柱，收集洗脱液为丙酮的洗脱相，浓缩近干得无色晶体；

5)称取0.5-5g二溴菊酸于100mL三口烧瓶，加入5-15mL氯化亚砜，搅拌回流2h，浓缩，得黄色液体3-(2′，2′-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基酰氯，用15mL THF溶解；

6)于100mL三口烧瓶中加入0.5-5g氰酸搅拌，用2mol/L NaOH溶解，将上述酰氯加入，冰浴下搅拌反应4h；

7)用乙酸乙酯提取产物，调节pH值至2.0，水洗，无水MgSO₄干燥，减压浓缩得到Med粗产物；

8)柱层析法纯化，用乙酸乙酯:石油醚(10：90→100：0)淋洗，浓缩得到黄色的Med产物。人工半抗原N-2-(羧基丙基)氨甲酰基-(3′-苯氧基苯基)甲基-3-(2′，2′-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙基羧酸酯Di的制备步骤如下：

1)称取0.5-5g Med于100mL三口烧瓶中，加入10mL氯化亚砜，搅拌回流2h；

2)减压浓缩，得黄色油状液体，用15mLTHF溶解并在4℃下冷却；

3)称取0.5-5g4-氨基丁酸于100mL三口烧瓶中，加入5mL的4mol/L NaOH溶液，冰浴下搅拌。

4)分5次加入酰氯的THF溶液，每次间隔10min，在后4次加料的同时加2mL 4mol/L NaOH加液完毕继续反应3h。

5)用浓HCl调节反应液的pH值至2.0，用乙酸乙酯萃取，水洗，无水MgSO₄干燥，减压浓缩，得到黄色的油状物。

6)薄层层析纯化(展开剂为：乙酸乙酯：石油醚：乙酸(30：79.5：0.5))，浓缩得到黄色Di产物。

溴氰菊酯人工抗原的分子结构式为：

    或    

        免疫原Di-BSA                           包被抗原Med-OVA

人工抗原的合成