[发明专利]一种棉花花粉发育过程中细胞DNA的荧光标记方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种棉花花粉母细胞DNA物质的荧光标记方法，属于生物技术领域。

二、背景技术

植物的小孢子发生到花粉母细胞的成熟的变化过程一直是生殖生物学研究的重要内容之一。对于棉花小孢子发生和雄配子发育过程的研究从20世纪就开始了，早期的研究方法主要是石蜡切片法，用苏木精或番红、固绿染色，随后发展到用超薄切片、电镜观测或离体培养、荧光染色。但直到现在为止，由于这些方法操作复杂，难以快速观察雄配子体发育的全过程，观察效果不理想。这主要有两方面的原因，一是实验材料自身的局限性；二是检测方法的局限性。

植物成熟的花粉粒的壁可分为外壁和内壁，外壁主要由孢粉素和纤维素等物质组成。其中孢粉素是一种难以分解、抗逆性强、耐高温的物质，稳定性强，具有抗强酸、强碱的特性，它使花粉粒的外壁非常牢固。内壁主要由纤维素和果胶质组成，易被酶类物质分解。棉属植物的花粉粒成熟时体积较大，直径大约为85-105μm左右，从四分体释放出来以后，形成一层不透明的结构非常致密的外壁，外壁的自发荧光非常强，使得染料渗透不到花粉内。因此如果采用染色薄壁花粉粒(如水稻、小麦花粉粒)的方法来对棉花成熟花粉粒进行染色，则完全观察不到它的内部结构。此外，前人在检测棉花雄配子体发育的过程时所用的染料的特异性不强，而且实验程序比较繁琐，周期较长。因此尚没有妥善的解决方法。

脱外壁花粉粒是指花粉粒被脱去外壁后，留下的内壁与原生质体，是介于完整花粉粒与花粉粒原生质体之间的一种结构单位，是一种可用于研究花粉形态与生理特性的独特材料。脱外壁花粉粒可用来研究内壁的表面结构、剥离的外壁结构与成分、内壁的沉积、新壁的合成等多方面的内容；脱外壁花粉粒由于排除了外壁对生物大分子的屏障作用，有利于染料分子的进入。用荧光染料对核DNA进行染色后，再用荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜观察，可研究花粉粒内部的核结构及其变化规律。本方法通过热激-氧化法制备脱外壁花粉粒，再用DNA荧光染料DAPI(4，6-diamidino-2-phenylindole，4，6-联脒-2-苯基吲哚)进行染色，建立了一种简便的制片程序，荧光显微镜研究了棉花花粉粒的结构特点及其细胞核的状态。DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染 料，它能粘附在DNA双螺旋的小沟区。DAPI-DNA复合物的激发和发射波长分别为360nm和460nm具有很高的光漂白承受水平。而且它还可以透过完整的细胞膜，用于活细胞和固定细胞的染色。本方法探索了用DAPI荧光染料进行检测棉花雄性配子体发育过程的试验，建立了完整可行的试验方法，操作步骤简单，试验效果稳定、清晰，因此无论是在科研、检测以及学生试验中都能得到很好的应用。

三、发明内容

技术问题本发明的目的在于提供一种较快速、有效的的检测棉花雄性配子体发育过程的方法。花蕾直径大于7mm时，花粉母细胞已经发育为幼嫩花粉粒，需通过次氯酸钠氧化热激脱去花粉粒外壁，再通过DAPI染色检测细胞内含DNA物质的核变化。花蕾直径小于7mm时，花粉母细胞还没有发育成幼嫩花粉粒，花粉壁还未形成，则不需要经过脱外壁处理即可染色镜检。

技术方案

一种棉花花粉母细胞DNA物质的荧光标记方法，包括以下步骤：

1)晴天早晨6—7点间随机摘取不同大小的棉花花蕾，剥去苞叶，固定于无水乙醇：冰醋酸配成体积比3:1的卡诺氏固定液，12—24h后转入体积比为70％的乙醇中，保存于4℃冰箱；

2)固定好的样品经体积浓度为50％、30％、10％的乙醇逐级下行至蒸馏水，每级停留2h；

3)直径小于7mm的花蕾，用解剖针剥离出其中的花粉母细胞，置于体积比0.1—0.2％的甘油中渗透2-3h；用pH7-8的磷酸缓冲液洗涤花粉母细胞，将花粉母细胞用0.5-1μg/ml的DAPI避光染色1-2h，细胞内DNA物质被荧光标记；

4)直径大于7mm的花蕾，用镊子剥离出其中的成熟花粉粒，加入质量体积比10％的次氯酸钠水溶液，室温振荡放置10min，再于60℃水浴处理10min；用pH7-8的磷酸缓冲液洗涤花粉粒；花粉粒置于体积比0.1—0.2％的甘油中渗透2-3h；用pH7-8的磷酸缓冲液洗涤花粉粒；再将花粉粒移至载玻片，加入100-200μL浓度为2μg/ml的DAPI溶液，盖片，适度用力斜压至外壁脱掉而花粉粒细胞不破裂为度，放在暗盒中静置10min后镜检，细胞内DNA物质被荧光标记。上述的方法中所述棉花为陆地棉。

有益效果