[发明专利]一种全氟辛酸的酶联免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种全氟辛酸类物质残留检测方法，更具体的说是对全氟辛酸 的一种酶联免疫检测方法，属于免疫检测技术领域。

背景技术

全氟辛酸及其盐(PFOA)是一种常用的氟表面活性剂，具有很强的疏水性 和疏油性，其化学结构远较其它表面活性剂稳定。由于它优异的耐热、耐低温、 自润滑性及化学稳定性等，被应用在航天、电子、化学和消防领域，并被用在生 活部门如不粘锅具、防水透气材料(如防水衣物)、皮革、汽车部件及微波炉爆 玉米花袋等。PFOA难以降解，在环境中具有积累性和持久性，但其对人及环境 的影响至今还没得出明确的结论。PFOA可通过摄取、吸入、皮肤接触而被吸 收，从而诱发癌症、肝肿大等疾病。一些动物实验表明，PFOA能够扰乱脂肪酸 的新陈代谢，影响生殖系统，可能与乳腺、睾丸、胰和肝肿瘤有关。PFOA的生 物毒性作用还包括对免疫系统产生抑制作用，干扰线粒体代谢，导致肝细胞损 伤，疾病感染致死等。由于其疏水疏油的特点，PFOA全氟有机物被生物摄取后 一般不在脂肪组织中积累，其大部分与血浆蛋白结合存在于血液中，其余一部 分则蓄积在动物的肝脏组织和肌肉组织中。由于它的这种分布特点以及没有很 好的检测方法，使得PFOA的污染问题很长时间没有受到科学家的重视。全氟表 面活性剂的研究在国际上已然成为环境科学和毒理学研究的热点，国内研究还 尚属起步阶段。现有的仪器检测法样品前处理复杂，所需的仪器昂贵，成本高， 检测时间长，很难实现对PFOA进行快速、准确的检测，有必要研究针对PFOA 的快速、便携的免疫检测技术。这就需要合成能产生簇特异性抗体的免疫原。 目前为止，国内外尚没有针对全氟辛酸PFOA的免疫检测方法的报道，为了弥补 这一空白，设计合成了直接以全氟辛酸(Perfluorooctanoic acid)为半抗原的用 于全氟有机物检测的完全抗原。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测全氟辛酸残留的免疫学检测方法，并 且有较高的灵敏度和特异性。

本发明的技术方案：一种全氟辛酸的酶联免疫检测方法，利用合成的全氟 辛酸免疫原(胥传来、李灼坤、彭池方等：一种全氟辛酸类药物通用人工抗原 的合成方法，中国专利申请号200810021105.X)免疫得到多克隆抗体，以全氟辛 酸为标准品，以全氟辛酸半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立全氟辛酸 的间接竞争酶联免疫检测方法；步骤如下：

(1)以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原1:5000～1:8000，加入酶 标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜，然后用含0.1％明胶的上述碳酸盐缓冲液 作为封闭液，封闭2h；

(2)用PBS将全氟辛酸标准品稀释成0.01，0.1，0.5，1，5，10，20ng/mL 系列浓度，及处理好的样品，分别加入到各自的酶标孔中，加50μL/孔；将多 克隆抗体以抗体稀释液梯度稀释，然后每孔加入50μL稀释好的多克隆抗体， 于37℃温育1h，然后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(3)将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP用抗体稀释液以 1:3000～1:5000进行稀释，然后每孔加入100μL，37℃作用1h后以PBST洗涤 液洗涤3～5次；

(4)每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；加入终止液2M硫酸溶 液，每孔100μL；酶标仪450nm测吸光值A₄₅₀，与所作标准曲线对比算出待 测样品的全氟辛酸含量。

配置显色液：

A液：0.933g柠檬酸，3.68g Na₂HPO₄·12H₂O，18μL30％H₂O₂用超纯水 定容至100mL；

B：60mg3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)溶于100mL乙二醇中；

使用前将A液与B液以5:1体积比混合。

更详细的步骤为：

主要溶液配制

1)配制磷酸盐0.01M(PBS)缓冲液：

Na₂HPO₄.12H2O        3.62g

KH₂PO₄               0.2g

NaCl                 0.2g