[发明专利]一种双酚A的酶联免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种烷基酚残留检测方法，更具体的说是对双酚A的一种酶联免疫检测方法，属于免疫检测技术领域。

背景技术

双酚A(Bisphenol A，BPA)是近几年从食品包装材料中新发现的一种“破坏内分泌化学物质(Endocrine Disrupting Chemicals，ECD)”，具有某些雌激素特性。BPA的发现引起了各国对食品及包装材料的广泛关注，已相继有从蔬菜罐头、婴儿用调制液、食品罐等检出BPA的报道。BPA是生产PC树脂及环氧(EP)树脂的主要原料，又用于酚醛树脂、可塑性聚酯、抗氧剂及聚氯乙烯(PVC)稳定剂等。因此，在食品包装材料、容器内壁涂料等方面有着重要的用途。在职业生产和日常生活中，BPA可通过皮肤、呼吸道、消化道等途径进入人体，BPA对皮肤、呼吸道、消化道和角膜均有中等强度刺激性。人类主要通过食用含有BPA材料包装的食物，使用婴儿奶瓶，牙科填充物和密封罐等摄入BPA。双酚A是一种弱雌性激素，对雄性生殖系统有一定的损害，具有内分泌干扰物作用，可能会引起性早熟，对胚胎也会有一定影响。BPA在低剂量时即具有DNA氧化损伤作用。BPA能诱导染色体异常，并能影响宿主的非特异性免疫防御系统。因此其食品包装材料中的残留也越来越引起了国内外的重视。目前，国内外有关双酚A的检测主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等。现有的这些仪器检测法虽然有灵敏度高、适用范围广等优点，但是样品前处理复杂，所需的仪器昂贵，成本高，检测时间长，因此有必要研究特异性强，灵敏度高，同时价格低廉，快速简便的免疫检测技术。近年来，国内外已经开展了对烷基酚类免疫分析方法的研究。但目前为止，国内尚没有更好的针对双酚结构多残留的免疫检测方法的报道，为此设计合成了以双酚A的类似物双酚酸为半抗原的用于双酚A结构检测的完全抗原。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双酚A的酶联免疫检测方法，快速检测双酚A残留的免疫学检测方法，并且有较高的灵敏度和特异性。

本发明的技术方案：一种双酚A的酶联免疫检测方法，利用合成的双酚A免疫原(胥传来、李灼坤、彭池方等：一种双酚A类药物通用人工抗原的合成方法，中国专利200810021104.5)免疫得到多克隆抗体，以双酚酸半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立了双酚A残留的间接竞争酶联免疫检测方法。

本发明通过以下步骤实现：

(1)以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原1:5000～1:8000，加入酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜，然后用含0.1％明胶的上述碳酸盐缓冲液作为封闭液，封闭2h；

(2)将系列浓度梯度的双酚A标准品、及处理好的样品，分别加入到各自的酶标孔中，每孔50μL；将多克隆抗体以抗体稀释液以1:6000～1:9000的比例稀释，然后每孔加入50μL稀释后的多克隆抗体；37℃温育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(3)将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP用抗体稀释液以1:3000～1:5000进行稀释，然后每孔加入100μL，37℃作用1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(4)每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；加入终止液2M硫酸溶液，每孔100μL；酶标仪450nm测吸光值OD，与所作标准曲线对比算出待测样品的双酚A含量。

配置显色液：

A液：0.933g柠檬酸，3.68g Na₂HPO₄·12H₂O，18μL 30％H₂O₂用超纯水定容至100mL；

B液：60mg3，3^/，5，5^/-四甲基联苯胺(TMB)溶于100mL乙二醇中；

使用前将A液与B液以5:1体积比混合。

更详细的步骤为：

主要溶液配制

1)配制磷酸盐0.01M(PBS)缓冲液：

Na₂HPO₄·12H₂O       3.62g

KH₂PO₄               0.2g

NaCl                 0.2g

KCl                  8.0g

加超纯水稀释至1000mL；