[发明专利]核盘菌群体中抗药性基因频率的高通量实时检测技术

权利要求书

1、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)群体中抗药性基因频率的实时检测方法，其特征在于采用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)技术检测核盘菌群体中存在的对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性基因频率。

一种核盘菌抗多菌灵的检测方法，共分三步

第一步：采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取已知抗药性菌株、敏感性菌株和待测样品的核基因组DNA。

第二步：运用抗药性菌株和核盘菌菌株的特异性检测引物和SYBR Green I为发光材料进行实时定量PCR反应，分别建立抗药性菌株和核盘菌菌株检测的标准曲线。

实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)反应体系及其扩增程序：

(1)核盘菌总量检测的标准曲线

反应体系：

dH₂O(灭菌蒸馏水)                             9μL

Premix Ex Taq^TM(2×)                     12.5μL

SclSF(10μM)                                  0.25μL

SclAF(10μM)                                  0.25μL

ROX Reference Dye(50×)                      0.5μL

DNA模板                                      2.0μI

总体积                                       25μL

扩增条件：

预变性：95℃                         10s

             ↓

变性：95℃                           5s

退火：55.8℃                         31s

40个循环

             ↓

延伸：72℃                           5min

Dissociation protocol                58℃

(2)抗性核盘菌量的标准曲线

反应体系：

dH₂O(灭菌蒸馏水)                          9μL

Premix Ex Taq^TM(2×)                 12.5μL

RFP4(10μM)                               0.25μL

RRP(10μM)                                0.25μL

ROX Reference Dye(50×)                  0.5μL

DNA模板                    2.0μL

总体积                     25μL

扩增条件：

预变性：95℃                     10s

                 ↓

变性：95℃                       5s

退火：62℃                       33s

40个循环

                 ↓

延伸：72℃                       5min

Dissociation protocol            58℃

第三步：待测样品分别运用上述两种特异性引物进行实时定量PCR反应，对照已经建立好的两个标准曲线，求出相应的抗药性菌株和敏感性菌株的数量和抗药性菌株在核盘菌总量中的比例。

2、根据权利要求1，核盘菌群体中抗药性基因频率的高通量实时检测技术其特征在于：用于实时定量PCR的引物具有特异性。设计的依据是抗药性菌株在β-微管蛋白第198为由Glu(GAG)→Ala(GCG)。

①扩增核盘菌β-微管蛋白基因片断的特异性引物对

上游引物SclSF：5’-CTCAAATCTCCGAAAGTT-3’

下游引物SclAF：5’-TGCAGACGGGTAATATG-3’

②扩增核盘菌抗药性基因片段的特异性引物对

上游引物RFP4：5’-TGGTCGAGAACTCTGA

下游引物RRP：5’-TTCAAACGGTATAATGGGC-3’