[发明专利]核盘菌群体中抗药性基因频率的高通量实时检测技术

说明书

一、技术领域

本发明属于一种核盘菌群体中抗药性基因频率的实时检测方法，可用于监测苯并咪唑类杀菌剂抗性核盘菌群体发展动态，进行抗药性油菜菌核病的流行预测。

二、技术背景

油菜菌核病是由核盘菌Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary引起的一种世界性病害，严重影响油菜的产量和品质。长期以来采用苯并咪唑类杀菌剂或以这类药剂为主的复配剂进行化学防治。苯并咪唑类杀菌剂作为一类高效、广谱内吸性杀菌剂在生产上应用，解决了保护性杀菌剂的环境毒性问题，提高了人类控制该病害的能力。苯并咪唑类杀菌剂包括多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、硫菌灵等。这些杀菌剂具有相同的抗菌谱和抗菌机制，他们也具有相同的抗药性机制，相互之间存在正交互抗药性。由于这类药剂的高度专化性，作用位点单一，加上施用频率高，使用2～3年后许多植物病原真菌群体中就会出现抗药性优势生理小种，使药剂防治完全失去效果。近年研究证明，核盘菌对多菌灵的抗药性产生是因为细胞中β-微管蛋白基因发生突变，使编码的蛋白质三维构象和电性分布改变，从而失去了与药剂分子的亲和性。β-微管蛋白基因编码198或200位氨基酸的密码子发生点突变是导致大多数病原菌产生田间抗药性的主要原因。

由于病原菌在自然界的数量巨大，抗药性个体在群体中的比例很低时(1％～5％)即可引起抗药性病害流行，使药剂防治失败。传统的检测方法需要分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，再根据药剂对菌丝生长的效应鉴别抗药性。这种对药剂的敏感性测定方法通常需要几周时间，工作量大，测定样本数量有限，抗药性基因频率在1％以下时难以发现。因此，传统的抗药性监测方法只能核实药剂防治失败是否由于抗药性造成，不能早期预警。早期检测病原群体中抗药性生理小种/抗药性基因的频率，及早实施抗药性治理策略和实施早期预警，是抗药性治理最有效的措施。在抗药性机制研究基础上，根据基因点突变的原理，应用常规的核酸技术如ASO-PCR技术等检测病原真菌对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的抗药性，则能快速、准确检测样本，但一个PCR反应体系只能检测一个菌株对多菌灵杀菌剂的敏感性，而且也只能在整个PCR反应体系结束之后通过电泳检测获得所测定的单个菌株对多菌灵敏感性。实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)方法则改变了病原菌对杀菌剂敏感性的检测只能单个样本进行检测，它具有(1)检测的高通量，即在一个反应体系中，可以对所有待检样品对杀菌剂的敏感性测定；(2)检测结果的实时性，在PCR反应进行中可以了解样品中抗药性菌株亚群体的大小；(3)高效性，经典的平皿法、常规的ASO-PCR等技术测定抗药性菌株只能进行单个对杀菌剂的敏感性的测定，而这种方法则同时对大量样品进行测定，耗时仅为6小时，可以准确了解当年的抗药性菌株亚群体发生、发展、流行的态势，有效的指导当年用药。(4)使在早期检测低频率的抗药性基因成为可能。

作者已研究实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)方法检测抗多菌灵的核盘菌，包括样品的前处理、基因组DNA的提取、实时定量PCR扩增的过程。

三、发明内容

技术问题  本发明的目的在于提供核盘菌抗多菌灵菌株亚群体一种快速检测方法。现有技术针对ASO-PCR探针特异性较差，为Real-time PCR进行探针的重新设计，反应体系优化。经过优化的反应体系和反应条件后，实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)能在油菜发病期6小时内进行大量、简便的抗药性亚群体的检测，检测准确率达到95％以上，对及时采取有效措施控制当季抗药性病害流行，具有实用价值。

技术方案  核盘菌抗多菌灵的检测基因，其β-微管蛋白基因，长度为1685bp，相应的编码β-微管蛋白的477个氨基酸，包含第198位氨基酸的抗药性突变位点Glu(GAG)→Ala(GCG).

一种核盘菌抗多菌灵的检测方法，一种核盘菌抗多菌灵的检测方法，共分三步：

第一步：采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取已知抗药性菌株、敏感性菌株和待测样品的核基因组DNA。

第二步：运用抗药性菌株和核盘菌菌株的特异性检测引物和SYBR Green I为发光材料进行实时定量PCR反应，分别建立抗药性菌株和核盘菌菌株检测的标准曲线。

核盘菌群体中抗药性基因频率的高通量实时检测技术的关键是用于实时定量PCR的引物具有特异性，设计的依据是抗药性菌株在β-微管蛋白第198为由Glu(GAG)→Ala(GCG)。

①扩增核盘菌β-微管蛋白基因片断的特异性引物对