[发明专利]一种宿主细胞及其用于重组蛋白高效分泌表达的方法

权利要求书

1.一种宿主细胞，其分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis r^-m^-，CBB3008，巳保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M208236。

2.权利要求1所述的宿主细胞，其特征在于其是一种高效、分泌合成工业酶制剂的地衣芽孢杆菌宿主细胞，革兰氏阳性杆菌，不形成芽孢，不形成色素；能够利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、甘油、乙醇、乙酸、淀粉、纤维素在20～50℃、pH5.5～7.8下生长；无内生质粒；其DNA限制性修饰系统编码基因簇被删除，遗传转化方便实现；引导工业酶制剂的高效分泌表达，表达水平达到15～30mg/mL。

3.权利要求1所述的宿主细胞，其特征在于最适生长温度42～45℃，最适生长pH6.8～7.2。

4.用权利要求1所述的宿主细胞进行重组蛋白高效分泌表达的方法，其特征在于通过基因克隆技术获得工业酶制剂的表达质粒，并在所述宿主细胞中实现高效分泌表达；在所述宿主细胞中高效合成工业酶制剂，再通过所处宿主细胞的蛋白分泌系统，将合成的酶蛋白高效分泌到培养基中；

(1)基因克隆与表达质粒的构建

表达质粒的构建所用表达载体pHY-WZX或pBL-WZX；表达测试用基因为：高温α-淀粉酶编码基因amyL，甘露聚糖酶编码基因manA，或植酸酶编码基因NcphyN；

上述基因经限制性酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化，克隆入表达载体pHY-WZX的EcoRI、KpnI或SmaI位点，获得相应的表达质粒pHY-amyL，pHY-manA或pHY-phyN；

(2)宿主细胞中实现高效分泌表达：

地衣芽孢杆菌电穿孔转化与重组菌的筛选，接种地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M208236于2.5mL LB培养基中，过夜培养后，转接入50mL生长培养基，即含0.65mol/L山梨醇的LB培养基中，于37℃培养至OD₆₀₀为0.75-0.85，将菌体在冰水浴中放置10min，于4℃、10000r/min离心10分钟收集菌体细胞，用预冷的含0.65mol/L山梨醇、0.70mol/L甘露醇和10％甘油的EP缓冲液反复洗涤菌体细胞4次，将菌体细胞悬浮于1mL的预冷EP缓冲液中，取100μL菌体细胞悬浮液分装于1.5mL Eppendorf管中，取50ng/μL表达质粒pHY-amyL，pHY-manA或pHY-phyN的DNA 1μL，与菌体细胞混匀，移入预冷的电转化池，1600v电击5ms后，加入含0.65mol/L山梨醇和0.45mol/L甘露醇的LB培养基的复苏培养基1mL，37℃、160r/min培养3h，然后涂布含0.025mg/mL卡那霉素或0.05mg/mL四环素的LB平板，于37℃培养2～3天；转化子通过测定酶活进行确认；

(3)合成的酶蛋白高效分泌：

发酵试验在250mL三角瓶中装30mL发酵培养基：酵母膏0.5％～1.5％，蛋白胨1.2％～3.6％，葡萄糖8％～20％；pH7.0；接种步骤(2)获得的转化子重组菌，42℃、220r/min下培养5～7天；发酵试验进一步在15L全自动发酵罐中进行，工作发酵体积10L，过程中维持溶氧为20％以上，并用硫酸或氨水控制pH7.0，定时取样分析，测定酶活。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于工业酶制剂，选用淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、或植酸酶。