[发明专利]一种宿主细胞及其用于重组蛋白高效分泌表达的方法

说明书

技术领域

本发明为一种用于重组蛋白高效分泌表达的芽孢杆菌宿主细胞。本发明中的宿主细胞为通过微生物菌种选育获得的芽孢杆菌。本发明的宿主细胞可以满足重组蛋白的高效合成并将合成的重组蛋白分泌到培养基中。本发明的宿主细胞高效制备的重组蛋白为具有工业应用价值的酶，进一步为具有淀粉水解活性的α-淀粉酶、植酸酶等大宗酶制剂。本发明属微生物学和发酵工程领域。

背景技术

从自然界获得的重要蛋白质，如酶、生物活性多肽、药用蛋白等，由于在自然条件下含量低，往往达不到商业开发价值，需要对其进行高效、低成本制备。实现这些重要蛋白质的高效、低成本制备的主要方法之一是，通过基因克隆技术，将这些重要蛋白质的编码基因在合适的表达宿主细胞中进行高效表达。由此获得的基因表达产物，即为重组蛋白。

基因表达宿主细胞(简称宿主细胞)是指，从自然界获得的或通过实验室操作获得的、能够满足特定基因的转录与翻译、并能将基因产物以一定形式和一定水平生产出、并保证所表达出的基因产物具有原蛋白质相似生物学活性与性能的生物体。

用于重组蛋白表达与制备的生物体可以是动物、植物或微生物。由于微生物细胞具有生长速度快、营养要求简单、易于遗传操作以及最重要的一点是能够进行大规模的人工培养，因此，微生物细胞是目前为止最主要的宿主细胞。

重组蛋白的分泌表达是指，重组蛋白的表达体系(表达载体与表达宿主细胞)能够引导所表达的重组蛋白实现跨膜运输，重组蛋白被运送到细胞膜外并被释放到培养环境(培养基)中。这就要求：1)宿主细胞具有完善的蛋白分泌与蛋白释放的能力与物质基础；2)所表达重组蛋白具有被宿主细胞蛋白分泌系统所识别与加工的标识。前者毫无疑问由所采用的宿主细胞决定；后者则由重组蛋白表达单元与宿主细胞共同决定。可见，实现重组蛋白分泌表达的决定性因素是宿主细胞。目前，应用于重组蛋白表达的常用基因表达宿主细胞大肠杆菌，仅有较弱的将重组蛋白分泌到其周质空间的能力，不能将其分泌到培养基中。因此，必须通过细胞裂解过程释放重组蛋白。另外一种已实现多种工业应用的宿主细胞为毕赤氏酵母，可以利用能够被其自身蛋白分泌识别系统所识别的、来源于酿酒酵母的α因子信号肽，引导重组蛋白的分泌。这是目前已报导的较好的重组蛋白分泌表达系统，但对大多数来源于细菌的蛋白的表达能力明显有限。

作为重组蛋白表达的微生物宿主细胞可以是直接通过自然筛选，从自然界中获得，也可以通过实验室技术改良现有微生物保藏物的若干生理、生化与遗传性能获得。大肠杆菌及其衍生菌株(如大肠杆菌JM109)、酵母及其衍生菌株(如毕赤氏酵母GS115)等都是目前常用的宿主细胞。大肠杆菌宿主细胞表达重组蛋白的水平，可以达到菌体蛋白总量的30％以上(Terpe.Appl MicrobiolBiotechnol，2006)；缺点是重组蛋白以不溶状态(包涵体)存在于细胞内，需要复杂的下游提取、纯化与复性等过程，才能制备出合格的重组蛋白。因此，大肠杆菌宿主细胞一般仅适用于实验室研究目的和高附加值药用蛋白的生产目的，不适用面广量大的工业酶制剂的生产。酵母宿主细胞表达重组蛋白的最高水平可以达到10mg/mL发酵液(Cregg JM，et al.Molecular Biotechnology，2000)，最大优点是能够在较高表达水平下，进行重组蛋白的分泌表达。不足之处是，与其它所有宿主细胞一样，酵母宿主细胞不能满足绝大多数重组蛋白的高效、分泌表达；另一个缺点是培养时间较长、生产过程中需要有害物质如甲醇的不断诱导。因此，其它类型的微生物宿主细胞的研究仍然是具有重要价值，并且在某种程度上是必需的。

除了上述描述的大肠杆菌和酵母宿主细胞，微生物宿主细胞的研究还包含有：枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌、黑曲霉、米曲霉等。

具有工业应用属性的宿主细胞，特别是运用于满足高效率、低成本、规模化生产要素的大宗工业酶制剂生产的宿主细胞，一般应具有如下基本特征：1)生物安全性菌株(即所为：General Regard As Safe，GRAS)；2)营养要求简单，培养条件不复杂；3)具有较强蛋白合成与分泌能力；4)可以进行遗传操作并且遗传稳定；5)可以进行大规模工业化培养与操作；6)产物分离容易；等。