[发明专利]检测ChIFN-γ的双单克隆抗体夹心ELISA方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学检测方法领域，具体涉及检测家禽细胞因子的双单克隆抗体夹心ELISA方法。

背景技术

γ-干扰素(IFN-γ，又称作免疫干扰素或II型干扰素)是细胞免疫应答的重要媒介，在机体免疫应答调节方面具有重要功能，尤其对诱导及维持Th1细胞免疫应答具有重要作用。Th1应答对抵抗胞内病原的感染非常重要，而IFN-γ分泌性T淋巴细胞的出现是Th1应答的标志。生物样品中IFN-γ的水平及IFN-γ分泌细胞的出现通常作为评价Th1免疫应答发生的标志。

目前检测细胞因子的方法很多，主要有生物活性测定法、免疫学检测法，利用核酸标记技术检测细胞因子等。但在复杂的生物样品中，对既定的细胞因子的功能分析很多情况下并不能反映其实际的功能。如，在保护细胞抵抗病毒感染的作用方面，I、II IFN均具有这种功能，尽管这两类IFN的结构并不是非常密切相关的，且由不同的细胞所分泌，但如果仅从功能上进行分析，并不能准确反映特定细胞因子的实际情况。而且，对特定的细胞因子而言，其活性半衰期很短，导致对其功能的分析不再能进行，尽管在样品收集时，这些细胞因子是存在的，在蛋白质水平上仍能分析，但由于其活性的半衰期很短，导致功能上的分析不再能进行。Northern blot，RNase protection及PCR等基因分析方法均高度敏感，且与目的基因完全匹配，但其只能停留在基因转录水平上的分析，很多信息是难以捕获的。

因此，急需一种能够定性和定量检测生物样品中IFN-γ的检测方法。尤其是针对胞内菌、寄生虫、病毒及其它病原引起的胞内感染，快速有效的细胞因子检测工具及检测方法对这类疾病的检测和诊断非常有益。目前，由于缺乏有效的检测工具及检测方法，对疾病条件下免疫状态的分析及评价很困难，为了改善这种现状，人们进行了许多努力，如生产重组细胞因子，研制特异性抗细胞因子mAb改进检测方法。

随着单克隆抗体技术的发展，检测细胞因子的酶联免疫吸附捕获方法(ELISA)得到了大力的发展。在其他的物种中，ELISA得到了很大的发展，并且被证明是一种非常稳定、可信、简单、易行的细胞因子检测方法，可用于检测经活化释放的细胞因子，因而，人们认为该方法是评价细胞免疫应答(CMI)的很好的指示方法。而且，这种检测方法是多用途的，不但可以用于检测丝裂原或许多病原再次刺激诱导的CMI，而且可用于检测免疫后激发的CMI。

鸡在大量的家禽胞内感染疾病方面是一个重要的动物模型，到目前为止，选择鸡作为家禽疾病的动物模型受到了许多限制，主要是因为缺乏适当的检测工具和检测系统。1995年Digby等成功克隆、表达出ChIFN-γ基因，对ChIFN-γ的研究蓬勃开展，其功能研究工作也在进行当中。2000年，Cheol H.等利用天然的或重组的ChIFN-γ研制出抗ChIFN-γmAb，并建立了直接ELISA方法检测艾美尔球虫感染鸡的血清ChIFN-γ水平；随后，B.Lambrecht等利用基因枪免疫法制备出抗ChIFN-γmAb，并运用纯化的抗ChIFN-γ多抗作为捕获抗体，生物素标记的mAb作为检测抗体，建立了检测ChIFN-γ的双抗体夹心ELISA方法。本发明采用原核表达的重组ChIFN-γ为免疫抗原及检测抗原，制备出抗ChIFN-γmAbs，运用纯化的抗ChIFN-γmAb作为捕获抗体，生物素标记的mAb作为检测抗体，建立检测生物样品中ChIFN-γ的双单抗夹心ELISA方法，该方法避免了运用多抗作为捕获抗体，保证了包被抗体的稳定性和均一性，因为不同批次制备出的多抗可能存在很大的差异，较难标准化，而mAb细胞株的优越性在于可以无限量地生产出具有均一特性的mAb。

ChIFN-γ抗原捕获ELISA可以在蛋白质水平上对ChIFN-γ进行评价，较生物学方法更为简便、实用、灵敏，便于操作和大面积使用。该方法的建立为检测鸡CMI提供灵敏的检测工具。而且，该方法将有利于研究ChIFN-γ在家禽的不同的免疫应答机制中的作用。

发明内容

本发明的目的在于建立一种简捷、实用、灵敏、高效的检测ChIFN-γ双单克隆抗体夹心ELISA方法。

本发明的技术方案是：检测ChIFN-γ的双单克隆抗体夹心ELISA方法，是：采用抗ChIFN-γ特异性mAb试剂，建立检测ChIFN-γ特异性双mAb夹心ELISA方法。该方法以mAb3E5作为捕获抗原，以生物素标记的mAb3E3作为检测抗体，建立检测ChIFN-γ的双mAb夹心ELISA方法。该方法可以灵敏地检测到微量的ChIFN-γ。

上述方法具体的步骤是：