[发明专利]肌酐诊断/测定试剂(盒)及肌酐浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种肌酐诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定肌酐浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

测定肌酐主要有化学测定法(Jaffe法)、酶法、高效液相层析法和毛细管电泳法等。

化学测定法成本低廉，操作简便，是目前国内测定肌酐最常用的方法之一。标本中的肌酐与苦味酸盐作用生成黄红色的苦味酸肌酐复合物。此法的缺点是特异性不高，维生素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高浓度葡萄糖、蛋白质和一些抗生素如青霉素G、头孢西丁、头孢唑啉等也能与碱性苦味酸反应生成红色。

高效液相层析法(HPLC)，肌酐在弱酸性环境中带正电荷，通过阳离子交换层析柱可与其他成分很好分离，在234nm测定其光吸收。此法分析的精密度高、特异性好，但本法不适于大批量临床标本分析，通常作为肌酐测定的参考方法，用于评价市售肌酐测定的试剂盒和某些科研目的。检索发现，申请号为90106198.0、申请日为1990.12.18的中国专利申请公开了用高效液相色谱直接测定人尿中假尿嘧啶核苷(简称假尿苷)，再通过分光光度法同时测出肌酐，分别用假尿苷和假尿苷/肌酐作为鼻咽癌和肺癌的标志物。(这个专利和我们的无关)

毛细管电泳法，血清标本用高速离心作预处理，尿液标本可用低速离心，除去有形成分，上清液用胶束动电毛细管电泳分离后测定235nm处吸光度。本法测定线性范围宽，操作较为简便，但需用特殊设备和进行血清标本的预处理，临床常规便用困难。

酶学测定法主要有肌酐脱亚胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶(Creatininase)两大类。

检索发现，申请号为02139298.6、申请日为2002.11.15的专利申请公开了应用酶反应产物氧化型烟酰胺辅酶配制的测定试剂。该发明所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰胺辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰胺辅酶或其类似物及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰胺辅酶或其类似物，当被还原的还原型烟酰胺辅酶或其类似物达到一定的浓度时，该发明所指的酶法试剂就可达到测定样本中丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的目的。该发明的特点在于为丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等的测试提供一个内源合成丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等反应所需要的底物-还原型烟酰胺辅酶。其缺点之一为，这个系统在生成反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的同时，也抵消了部分丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成试剂测试的准确性大大降低。其缺点之二是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段时间，以便能够产生足够的还原型烟酰氨辅酶，这样一来就造成了缓不济急的结果，给测试带来很大的不便。

据申请号为02139298.6、申请日为2002.11.15的专利介绍，该系统由于不断生成测定所需的NADH或NADPH，从而大大提高了试剂的稳定性，并大大降低试剂的生产成本。其实在试剂中加入NADH或NADPH的稳定剂已经不是困难或增加成本的问题，反而比在试剂中增加一个反应系统要经济得多。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用间接酶循环扩增法(IndirectEnzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定肌酐浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的肌酐诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行肌酐浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明肌酐浓度测定方法如下：

肌酐+水肌酐脱亚胺酶N-甲基海因+氨

氨+丙酮酸+吲哚色氨酸酶/K⁺色氨酸+水