[发明专利]一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒及其制备及检测方法

权利要求书

1、一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒，其包括洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，其特征是其还包括由96或48或24孔包被板、三聚氰胺标准品、三聚氰胺的抗体冻干品、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。

2、一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的制备：其特征在于：其包括以下步骤：三聚氰胺标准品的制备、96孔或48孔或24孔包被板的制备、三聚氰胺-卵清蛋白偶联物的制备、三聚氰胺与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物制备、抗三聚氰胺单克隆抗体及其溶液的制备、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备、洗涤液的制备、显色液A的制备、显色液B的制备、终止液的制备。

3、根据上权利要求2所述一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的制备：其特征在于：所述的酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体冻干品，洗涤液为含有吐温和NaN₃的磷酸盐缓冲溶液，显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，终止液为硫酸溶液；所述三聚氰胺标准品从三聚氰胺纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，三聚氰胺浓度为：0.001ng/mL～1000ng/mL。

4、根据上权利要求2所述一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的制备：其特征在于：所述96孔或48孔或24孔包被板包被固相抗原的制作方法：用10mmol/L～100mmol/L pH9～10 Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液将三聚氰胺-卵清蛋白适当稀释做为包被液，分别加入到96或48或24孔微孔板各孔中，2℃～8℃放置过夜，弃去包被液，洗涤3次，按250μl/孔加入含1％～3％牛血清白蛋白，pH7～8左右的磷酸盐缓冲液，2℃～8℃封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-40℃～-20℃左右冷冻保存。

5、根据上权利要求2所述一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的制备：其特征在于：所述三聚氰胺-卵清蛋白(OVA)偶联物的制备：

称取一定量三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，分别加入琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物至反应完毕，然后低温浓缩至干，得半抗原；将所得半抗原，溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，分别加入N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌过夜，反应液离心，取上清，缓慢滴加到一定浓度的OVA溶液中，室温下搅拌反应4小时～6小时，PBS透析2天～3天，冷冻干燥后于-40℃～-20℃左右保存；上述反应成分摩尔比比例为：三聚氰胺：琥珀醛酸：氰基硼氢化钠＝(0.5～1)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；半抗原：DCC：NHS：OVA＝(50～500)：(100～500)：(100～5000)：(0.5～2)。

6、根据上权利要求2所述一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的制备：其特征在于：所述三聚氰胺与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物制备：

称取一定量三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，分别加入琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物至反应完毕，然后低温浓缩至干，得半抗原；将所得半抗原，溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，分别加入N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌过夜，反应液离心，取上清，缓慢滴加到一定浓度的BSA溶液中，室温下搅拌反应4小时～6小时，PBS透析2天～3天，冷冻干燥后于-40℃～-20℃左右保存；上述反应成分摩尔比比例为：三聚氰胺：琥珀醛酸：氰基硼氢化钠＝(0.5～1)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；半抗原：DCC：NHS：BSA(摩尔比)＝(50～500)：(100：500)：(100～5000)：(0.5～1.5)。