[发明专利]一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒及其制备及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及生物检测领域，用于对饲料及食品中的三聚氰胺含量的检测，具体为一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒及其制备及检测方法。

(二)背景技术

三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料，简称三胺，又叫蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。三聚氰胺是一种用途广泛的基本有机化工中间产品，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂(MF)的原料。由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，常被人为添加进动物饲料及植物蛋白中以提高产品中蛋白质含量，而长期或反复大量食用含有三聚氰胺的饲料或食物，会造成动物或人类生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。因此，有必要对饲料及食品中的三聚氰胺的含量进行检测。

目前检测三聚氰胺方法主要有重量法、升华法。近几年发展起来的方法主要有高效液相色谱法和气质联用法，这些色谱方法具有很好的灵敏度和特异性，但操作繁琐，需要昂贵的仪器设备，且耗时长，检测成本高，而酶联免疫吸附法(ELISA)快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高，特异性强，简化了样品预处理和纯化过程，特别适用于大批量样品的检测。关于三聚氰胺的ELISA检测鲜见报道。

(三)发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒，其检测快速准确、操作简便，且无需贵重仪器设备，检测成本低，为此，本发明还提供了测试盒的制备及使用该测试盒的的检测三聚氰胺的专用检测方法。

一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒，其包括洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，其特征是其还包括由96或48或24孔包被板、三聚氰胺标准品、三聚氰胺的抗体冻干品、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。

一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的制备：其特征在于：其包括以下步骤：三聚氰胺标准品的制备、96孔或48孔或24孔包被板的制备、三聚氰胺-卵清蛋白(OVA)偶联物的制备、三聚氰胺与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物制备、抗三聚氰胺单克隆抗体及其溶液的制备、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备、洗涤液的制备、显色液A的制备、显色液B的制备、终止液的制备。

其进一步特征在于：

所述的酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体冻干品，洗涤液为含有吐温和NaN₃的磷酸盐缓冲溶液，显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，终止液为硫酸溶液；

所述三聚氰胺标准品从三聚氰胺纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，三聚氰胺浓度为：0.001ng/mL～1000ng/mL；

所述96孔或48孔或24孔包被板包被固相抗原的制作方法：用10mmol/L～100mmol/L pH9～10 Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液将三聚氰胺-卵清蛋白适当稀释做为包被液，分别加入到96或48或24孔微孔板各孔中，2℃～8℃放置过夜，弃去包被液，洗涤3次，按250μl/孔加入含1％～3％牛血清白蛋白，pH7～8左右的磷酸盐缓冲液，2℃～8℃封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-40℃～-20℃左右冷冻保存；

所述三聚氰胺-卵清蛋白偶联物的制备：

称取一定量三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，分别加入琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物至反应完毕，然后低温浓缩至干，得半抗原；将所得半抗原，溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，分别加入N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌过夜，反应液离心，取上清，缓慢滴加到一定浓度的OVA溶液中，室温下搅拌反应4小时～6小时，PBS透析2天～3天，冷冻干燥后于-40℃～-20℃左右保存；上述反应成分比例为：三聚氰胺∶琥珀醛酸∶氰基硼氢化钠(摩尔比)＝(0.5～1)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；半抗原：DCC：NHS：OVA(摩尔比)＝(50～500)：(100～500)：(100～5000)：(0.5～2)；

所述三聚氰胺与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物制备：