[发明专利]一种基于分子伴侣添加技术的ELISA检测试剂盒及其方法

权利要求书

1、一种分子伴侣添加剂，其特征在于，它是由原核表达纯化的极高可溶性及活性的蛋白。

2、如权利要求1所述的分子伴侣添加剂，其特征在于，所述分子伴侣是HSP60。

3、如权利要求1所述的分子伴侣添加剂，其特征在于，它是用于ELISA试剂盒的添加剂。

4、分子伴侣添加到NGAL的ELISA试剂盒提高试剂盒质量的方法，包括：蛋白克隆，表达，分离和纯化及在NGAL试剂盒中添加使用的方法。

5.如权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于是针对于定性及定量检测各种样品中NGAL含量的试剂盒。

6.如权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于其高效特异性检测NGAL蛋白的抗原位点。

7.如权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于其利用抗体对或单个包被抗体，利用双抗体夹心法或竞争法定性和定量检测样品中NGAL。

8.如权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于其所用抗体含有NGAL的多克隆抗体。

9、如权利要求1所述的融合蛋白分子伴侣，其特征在于，所述表达是将质粒PET28A-HSP60在大肠杆菌中表达和培养。

10、如权利要求1所述的融合蛋白分子伴侣，其特征在于，所述分离是指将大肠杆菌破碎，然后离心或过滤分离出分子伴侣蛋白。

11、如权利要求1所述的融合蛋白分子伴侣，其特征在于，所述破碎可采用电动捣碎机或匀浆机破碎，或用超声波处理破碎，或用溶菌酶处理。

12、如权利要求1所述的融合蛋白分子伴侣，其特征在于，所述纯化是用层析法或电泳法进行。

13、如权利要求1所述的融合蛋白分子伴侣，其特征在于，所述分子伴侣通过以下述步骤制备：

1)PCR扩增表达HSP60的基因片段，两端带有NdeI和XhoI酶切位点，酶切消化后插入NdeI和XhoI消化后的Pet28a，得到质粒PET28a-HSP60；

2)HIS-HSP60在大肠杆菌Rosetta中表达，克隆接种至3ml含有100μg/ml kana的LB缓冲液，37℃，过夜，220rpm；将过夜培养物1∶100稀释至1L含有100μg/mlkana的LB缓冲液，37℃，220rpm，培养5h；加入终浓度为0.1mM的IPTG，22℃，180rpm，继续培养22h；以8000g，15min，4℃离心收菌；菌体用50mM Tris-cl，200mM NaCl pH8.0悬起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT，0.5h；用超声破碎仪超声至溶液澄清，12000rpm，20min离心3次；

3)将上清液使用GE healthcare的chelating sepHarose Fast Flow柱料纯化，得到纯化后的融合蛋白。

4)凝血酶酶切HIS标签，Ni柱纯化，得到除去标签的HSP60蛋白。