[发明专利]一种基于分子伴侣添加技术的ELISA检测试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，特别是涉及以分子伴侣作为添加剂提高ELISA检测试剂盒质量的方法。

背景技术

蛋白表达过程中，许多蛋白质不能按正确的方式折叠。错误折叠的蛋白质经常将含碳丰富的氨基酸暴露在表面，而不是被包裹在内。这些含碳丰富的基团会跟其它蛋白质中的类似基团紧密结合，构成大分子聚合物。这些聚合物本身失去自身生物学活性，并可使周围蛋白聚集沉淀，在细胞内存在时往往是致死的。

分子伴侣是一种引导蛋白质正确折叠的蛋白质。当蛋白质折叠时，它们能保护蛋白质分子免受其它蛋白质的干扰。很多分子伴侣属于热休克蛋白，它们在细胞受热时大量合成。热激可导致多数蛋白质稳定性降低，增加错误折叠的几率，因此在受到热刺激时，细胞中的蛋白质需要更多热休克蛋白的帮助。

HSP60是一种典型的分子伴侣，它可以为正在折叠的蛋白质提供一个附着环境，从而起到保护折叠过程的作用。未折叠的蛋白质进入其结构内的空穴，便可以在其中完成折叠。

模拟体内环境，在ELISA试剂盒实际生产中，试剂盒的成分里面，抗体、标准品、酶标物等均为蛋白成分，在运输过程以及分装使用过程中，由于蛋白浓度比较低，反应条件及温度环境等外界因素不稳定，这些蛋白质很容易受到影响而变性失活。而添加分子伴侣之后，蛋白将受到分子伴侣蛋白的保护，并且给部分变性蛋白提供一个复性的环境，从而间接的优化试剂盒的保质期、稳定性、准确性等方面的品质。

NGAL蛋白是1993年在中性粒细胞内首先被发现的，与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展等过程相关。近年来国内外的研究表明，NGAL蛋白在多种疾病发病过程中具有特异性表达变化的特点，使得NGAL成为检测疾病的生物标志物。本发明中依据NGAL抗原决定簇特点，选择两个不同位点，表达抗原，免疫家兔获得抗体，开发出特异性针对于NGAL蛋白的抗体对。并通过质量控制，投入研发试验，为双抗体夹心法、竞争ELISA法及其他利用抗体检测样本中NGAL含量的检测方法提供基础。

本发明中，使用HSP60蛋白作为NGAL的ELISA试剂盒蛋白组分添加剂，检测并验证HSP60对于该试剂盒的有效作用。

发明内容

本发明的目的是通过添加分子伴侣蛋白的方法提高NGAL ELISA试剂盒的性能。

所述分子伴侣是HSP60。

本发明的另一目的是提供添加分子伴侣的ELISA检测试剂盒，及分子伴侣表达、分离和纯化的方法。

所述分子伴侣获得依照如下进行：将HSP60编码基因插入表达载体PET28a，得到PET28a-HSP60。

所述表达是将质粒HIS-HSP60在大肠杆菌中表达和培养。

所述分离是指将大肠杆菌破碎，然后离心或过滤分离出融和蛋白。破碎可采用电动捣碎机、或匀浆机破碎、或用超声波处理破碎，也可以用溶菌酶处理。

所述纯化是用本领域内常用的层析法或电泳法进行，优选凝胶层析法进行。

具体的说：上述步骤如下进行：

1)PCR扩增表达HSP60的基因片段，两端带有NdeI和XhoI酶切位点，酶切消化后插入NdeI和XhoI消化后的Pet28a，得到质粒PET28a-HSP60；

2)HIS-HSP60在大肠杆菌Rosetta中表达，克隆接种至3ml含有100μg/ml kana的LB缓冲液，37℃，过夜，220rpm；将过夜培养物1∶100稀释至1L含有100μg/mlkana的LB缓冲液，37℃，220rpm，培养5h；加入终浓度为0.1mM的IPTG，22℃，180rpm，继续培养22h；以8000g，15min，4℃离心收菌；菌体用50mM Tris-cl，200mM NaCl pH8.0悬起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT，0.5h；用超声破碎仪超声至溶液澄清，12000rpm，20min离心3次；

3)将上清液使用GE healthcare的chelating sepHarose Fast Flow柱料纯化，得到纯化融合蛋白。

4)凝血酶酶切HIS标签，Ni柱纯化，得到除去标签的HSP60蛋白。

实验证明，纯化后HSP60可溶性极高，20mg/ml HSP60在50mM Tris，500mMNaCl中保存，于4℃几个月内未见明显沉淀未有降解、FPLC表明HSP60为单体，一年内未有聚合物出现。