[发明专利]一种酶法降解槐豆胶生产半乳甘露寡糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶法降解槐豆胶生产半乳甘露寡糖的方法。

背景技术

槐豆胶是以甘露糖为主链的半乳甘露聚糖，其中半乳糖与甘露糖的平均摩尔比为1：4，可用作食品的增稠剂、乳化剂、稳定剂等。甘露聚糖经降解后形成的甘露寡糖作为双歧杆菌的增殖因子，可有效地使人体内的有益菌自然增殖、改善肠道菌群结构、调节肠道功能，因此甘露寡糖具有保肝、抗肿瘤、增强免疫力、加强肠道蠕动、降低胆固醇、抗衰老等生理活性，适用于各种肠道疾病，同时也适合于健康人特别是老年人和儿童的日常保健，已广泛地作为添加剂或功能因子应用于食品和饲料中。目前尚未见到酶法降解槐豆胶生产半乳甘露寡糖方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶法降解槐豆胶生产半乳甘露寡糖的方法，制备的半乳甘露寡糖产品可用于构效关系研究，为低聚糖药物和保健食品的研制开发提供高品质的候选化合物。

一种酶法降解槐豆胶生产半乳甘露寡糖的方法，其特征是配制产酶培养基，接种嗜碱芽孢杆菌，发酵，提取甘露聚糖酶粗酶液，另使槐豆胶溶于缓冲溶液中，加入上述甘露聚糖酶粗酶液进行酶解反应，用沸水浴加热使甘露聚糖酶失活，离心后除去沉淀杂质，浓缩后用有机溶剂沉淀分级，冷冻干燥后获得半乳甘露寡糖片段。

本发明的制备方法对环境设备要求不高，简单易行，成本低廉，产物组成简单，制备条件温和，产物结构稳定性好，适于推广。

附图说明

附图为槐豆胶降解产物的ESI-TOF-MS分析图。采用电喷雾飞行时间质谱(ESI-TOF-MS)确定降解产物的组成和分子量范围，附图表明槐豆胶酶解产物为分子量组成简单的四糖、五糖、六糖。

峰组成I：半乳甘露四糖，分子量为666；

峰组成II：半乳甘露五糖，分子量为828；

峰组成III：半乳甘露六糖，分子量为990。

具体实施方式

本发明所用菌种嗜碱芽孢杆菌能够在营养肉汤或牛肉膏蛋白胨培养基等普通细菌培养基上进行培养，液体振荡培养18-24小时后生长达到对数期，此时的培养液可作为发酵种子用于产酶培养基的接种。按以下组分配制产酶培养基：瓜尔豆胶4g，豆粉20g，(NH₄)₂HPO₄ 5g，NH₄Cl 1g，K₂HPO₄·3H₂O 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g，CaCl₂ 0.1g，FeSO₄·7H₂O 0.001g，最后加水至总重量为1kg，用1M的NaOH或HCl水溶液调产酶培养基的pH至8.0。产酶培养基经121℃20分钟高压蒸汽灭菌后，冷却至室温，按4％的接种量向产酶培养基内接种处于对数期的嗜碱芽孢杆菌培养液，在32℃，150r/min条件下进行液体振荡发酵，发酵36小时后发酵液中的甘露聚糖酶活力达到最高峰，为8.26U/mL。酶活力单位(U)定义为50℃反应条件下每分钟释放1μmol相当于D-甘露糖的还原糖所需的酶量。

发酵液经7000r/min离心15分钟后，离心上清液即可作为甘露聚糖酶粗酶液，用于槐豆胶的降解。将8g槐豆胶加入到100mL pH为7.5的1/15mol/L Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液中，搅拌均匀，制成重量百分浓度为8％的槐豆胶溶液，再加入含有80个酶活力单位的甘露聚糖酶粗酶液，于50℃150r/min振荡条件下酶解反应12小时。由于酶解反应采用在50℃条件下高温反应，能够有效地抑制反应过程中杂菌的生长，从而保证酶解生成的半乳甘露寡糖不会受到破坏，提高了产物的得率和纯度。为了防止反应过程中杂菌的生长，也可向反应液中加入重量百分浓度为0.01％的叠氮化钠，但操作时必须注意反应液不得与皮肤表面发生接触。

酶解反应结束后，用沸水浴加热5分钟使酶失活，冷却至室温后于3000r/min离心7min以去除酶解液中的未降解成分和不溶性杂质，收集上清液，即为低浓度的半乳甘露寡糖水溶液，于60℃旋转蒸发进行浓缩，注意温度不应高于65℃，否则浓缩液的颜色加深，影响产品外观。浓缩液体积为20mL左右时，停止旋转蒸发，冷却至室温后，加入4倍体积的无水乙醇使半乳甘露寡糖得到沉淀，3000r/min离心7min收集沉淀物，经冷冻干燥后得到半乳甘露寡糖。