[发明专利]鸭肝炎Ⅰ型病毒间接血凝诊断抗原的制备及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法，具体涉及一种通过鸭肝炎I型病毒抗原致敏双醛化绵羊红细胞制备间接血凝诊断抗原的方法。

背景技术

鸭病毒性肝炎又称鸭肝炎，俗称“背脖病”，主要发生于三周龄以下雏鸭，是一种传播迅速、高度致死性的传染病，该病可由三种不同的病原引起，分别称为DHV-I、DHV-II和DHV-III型；3个血清型之间无交叉保护性。其中DHV-I主要侵害4周龄以内的雏鸭。特别是不足1周龄的雏鸭最易感染，死亡率可达90％以上，且其引起的鸭病毒肝炎呈世界性分布，是危害养鸭业最为严重的传染病之一。我国流行的主要为I型鸭病毒肝炎。1998年至1999年间，程安春在我国首次发现有II型DHV的存在。随着集约化养殖水平的提高，该病的流行趋势在增强，因而建立快速、灵敏和特异的血清学诊断方法势在必行。

目前，鸭病毒肝炎检测技术主要有病毒分离技术和血清学检测技术等。中和试验是检测鸭病毒肝炎的经典方法。该法检测结果准确可靠，是目前公认的一种权威方法。但其繁琐、费时、成本高，不能用于快速检测，不适于基层的推广应用。近年来，间接血凝试验(IHA)经过不断改进后已广泛应用于检测血清中各种病原的抗体，与ELISA相比，间接血凝试验操作过程简便、节省时间，且不需要特殊仪器。

本研究采用DHV-I抗原致敏双醛化绵羊红细胞，且对间接血凝诊断抗原工艺进行优化，旨在建立一种简便、稳定、敏感、特异性强、保存期长的用于检测鸭病毒性肝炎流行病学调查及抗体水平检测的方法。

发明内容

本发明的要解决的技术问题在于提出一种鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法。

本发明的要解决的又一技术问题在于提出一种诊断鸭肝炎I型病毒的试剂盒。

本发明要解决上述技术问题所采用的技术方案为：

本发明的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法，包括以下步骤：

1、双醛化绵羊红细胞的制备：

取质量百分比浓度为8％绵羊红细胞悬液1重量份，边搅拌边滴加质量百分浓度为3％丙酮醛1重量份，24～26℃搅拌15～18小时，3000r/min离心15～20分钟，弃上清，红细胞用PBS溶液洗涤，用PBS溶液配制成质量百分比浓度为8％的红细胞悬液；

取上述红细胞悬液1重量份，边搅拌边滴加质量百分浓度比为3％甲醛溶液1重量份，24～26℃搅拌15～18小时，3000r/min离心15～20分钟，取红细胞用PBS溶液洗涤，用PBS溶液配制成质量百分比含量为8％的红细胞悬液，添加质量百分比浓度为0.2％的叠氮钠；

2、双醛化红细胞的鞣酸化

取质量百分比含量为8％的双醛化红细胞40毫升，用pH7.0，0.01mol/LPBS溶液洗涤，加入体积为质量百分比含量为8％的双醛化红细胞溶液的5倍的pH7.0，0.01mol/L PBS溶液，混匀后搅拌，加热至37℃，加入体积为质量百分比含量为8％的双醛化红细胞溶液1.25倍的质量体积比为0.01％的鞣酸溶液，全部加完后搅拌30～60分钟，离心，弃上清，红细胞泥用0.15mol/L，pH 6.4的PBS洗涤，离心后在沉淀物内加入体积为质量百分比含量为8％的双醛化红细胞溶液的3.925倍的0.15mol/L，pH 6.4的PBS即为2％的双醛化鞣酸化红细胞；

3、鸭肝炎I型病毒抗原致敏双醛化鞣酸化绵羊红细胞

将鸭肝炎I型病毒抗原贮存液用0.15mol/L、pH为6.4的PBS溶液稀释10倍，将稀释后的鸭肝炎I型病毒抗原溶液加入2倍体积的质量百分比浓度为8％双醛化鞣酸化红细胞悬液，充分混合，37℃水浴致敏60～90分钟，1500r/min离心10～15分钟，沉淀加3倍体积的质量百分比浓度为0.25％的血清白蛋白悬浮，37℃水浴30～60分钟，1500r/min离心10～15分钟，沉淀用0.15mol/L、pH为6.4的PBS溶液洗涤，加入体积为鸭肝炎I型病毒抗原贮存液160倍的0.01mol/L、pH为7.0的PBS溶液，即成鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原。

在步骤(1)中绵羊红细胞悬液的制备方法为：在1重量份的健康青年公绵羊血中加入阿氏液1～1.2重量份，混匀，1～4℃存放3～5d后过滤；过滤后的血液每重量份中加入生理盐水9重量份，混匀，1000r/min离心10～15分钟，取红细胞加入9倍重量的生理盐水洗涤4～6次，用含有质量百分比含量为0.85％氯化钠、pH值为7.2的PBS配成重量百分比为8％红细胞悬液。