[发明专利]培养转基因兔成体成纤维细胞克隆胚胎的方法

说明书

技术领域

本发明涉及培养转基因兔成体成纤维细胞克隆胚胎的方法。

背景技术

哺乳动物体细胞核移植(SCNT)技术的出现，不仅为发育生物学提供了研究胚胎发育早期蛋白质与DNA相互关系的模型，同时也为遗传工程和种质资源的保存提供了新的途径。

兔，作为应用广泛的实验动物和经济动物，有着独特的优点：兔的体积中等，性格温顺，适合笼养，费用低廉；兔的世代周期短，孕期只有一个月，繁殖快，而且长年发情，无季节限制；兔体积相对比小鼠大，血液量大，是研究心血管系统，肺部疾病，眼科疾病，药物毒性试验，代谢疾病的良好的实验材料。因此通过基因改造产生转基因模式动物兔有着良好应用前景。另外通过转基因技术获得兔的乳腺生物反应器，生产药用蛋白也有较高的应用价值。

但迄今为止，生产转基因兔的技术还仅局限于原核注射技术，但是原核注射的结果是随机整合的，效率低而且容易基因丢失，产生转基因嵌合体。而近年来最为常用的基因打靶技术，由于打靶效率低，只能建立在大量样本的基础上，所以无法与原核注射技术相结合使用。但是对体外培养的细胞进行基因打靶则可以收到好的效果。所以利用基因打靶以后的细胞进行核移植，最终制备定点突变的转基因克隆兔，将对转基因兔的制备将起到革命性的推动作用。因此利用能够大规模体外培养的细胞制备克隆兔的技术首先成为了研究的热点。

兔的体细胞克隆，至今仍是一个世界性的难题，世界上有多个试验小组对此进行了研究，虽然获得了比较高的囊胚率，但没有获得妊娠到期的克隆兔，只有2002年Chesne等通过改变克隆胚胎的激活和胚胎移植过程，获得了来源于新鲜颗粒细胞的克隆兔，取得了该物种克隆技术的突破。但是，由于颗粒细胞只能来源于性成熟的雌性兔，而且体外培养困难，所以没有基因改造的时间窗口。成纤维细胞在体内的分布广泛，而且不受性别，年龄和生理状态的限制，在体外可以长时间的培养，并进行遗传改造。

发明内容

本发明的目的是提供一种培养转基因兔克隆胚胎的方法。

本发明所提供的培养转基因兔克隆胚胎的方法，是将转入目的基因的兔成体成纤维细胞与去核的兔卵母细胞融合，得到重构复合体，获得克隆胚胎。

其中，所述方法中，还包括激活所述重构复合体。激活所述重构复合体包括如下步骤：

1)用3000-3500V/cm直流电，电击15-20us，电击三次，每次间隔一秒；

2)电极后用4-6ug/mL放线菌酮和1-3mM6-二叔甲基氨基嘌呤处理0.5-1.5h。

激活所述重构复合体优选包括如下步骤：

1)用3000V/cm直流电，电击20us，电击三次，每次间隔一秒；

2)电极后用5ug/mL放线菌酮和2mM6-二叔甲基氨基嘌呤处理1h。

所述转入目的基因的兔成体成纤维细胞是通过如下方法获得：培养兔成体成纤维细胞，所述兔成体成纤维细胞传代培养至3-13代后，将含有目的基因的质粒导入所述兔成体成纤维细胞，获得转入目的基因的兔成体成纤维细胞

所述去核的兔卵母细胞是按照如下方法获得的：

1)在成年母兔注射HCG 13-15h小时后取卵丘卵母细胞复合体；

2)所述卵丘卵母细胞复合体用50-100IU/ml透明质酸酶消化，然后去除卵丘细胞，获得卵母细胞；

3)采用spindleview(纺缍体观测)系统去除所述卵母细胞的细胞核，获得去核的兔卵母细胞。

所述去核的兔卵母细胞优选按照如下方法获得的：

1)在成年母兔注射HCG 14h小时后取卵丘卵母细胞复合体；

2)所述卵丘卵母细胞复合体用100IU/ml透明质酸酶消化，然后去除卵丘细胞，获得卵母细胞；

3)采用spindleview系统去除所述卵母细胞的细胞核，获得去核的兔卵母细胞。

本发明培养转基因兔成体成纤维细胞克隆胚胎的方法通过核移植技术获得了转基因兔成体纤维细胞克隆胚胎，复合体融合率达到67％，克隆胚胎的卵裂率达到73％，该克隆胚胎经过胚胎移植获得了有繁殖能力的克隆兔。本发明的方法将大量的转基因后的筛选工作由个体的水平转为细胞水平，大大改善了转基因的效率和效果。并且兔成体成纤维细胞经过长时间的培养和转基因的操作，仍有支持克隆胚胎全程发育的能力，这为对体细胞进行精细的基因打靶操作提供了足够的时间，为进行兔基因组的遗传操作创造了条件。

附图说明

图1为转染2天后的成纤维细胞

A：成纤维细胞荧光图像，A’成纤维细胞明场图像。

图2为消化分离后的转基因成纤维细胞系