[发明专利]一种毛细管和微流控芯片电泳通道中蛋白质的荧光成像表征方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种毛细管和微流控芯片电泳通道中蛋白质的荧光成像表征方法，用以表征微分离通道中的蛋白质吸附现象和蛋白质涂层材料的性能。

背景技术

毛细管电泳和微流控芯片技术作为基因组学和蛋白质组学研究的一种新技术平台，受到越来越多的关注。尤其在基因测序和蛋白质分析方面，更是显示出独特的应用优势。

在蛋白质分离过程中，被分离的蛋白质会在石英毛细管或微流控芯片通道内通过静电吸引而产生吸附，造成样品浓度变化及毛细管表面能的变化，从而引起峰拖尾和分辨率降低。蛋白质的不可逆吸附，为毛细管电泳和微流控芯片技术用于蛋白质组学的研究带来一个瓶颈问题。

然而，蛋白质的吸附问题对于具体研究而言也并非是完全不利的因素。随着人们对蛋白质功能的认识不断深入，蛋白质越来越多地被用来进行药物筛选、临床诊断以及与生命科学相关的相互作用研究。为此，人们通过物理或化学的方法把蛋白质固定到分离通道中，形成具有生物活性的涂层，借以发展适于生化和医疗健康方面研究的新方法和工具。

对非特异性的蛋白质吸附的发生，人们通常通过对电渗流的测定及其稳定性考察等间接手段加以判断。然而对于蛋白质吸附发生的部位、程度以及这些因素与分离效率间的关系，还没有很好的方法加以验证。与之相类似，根据不同的研究目的构建的蛋白质涂层，其性能也多借助电渗流的测定和样品分离效率来考察，缺乏更为确切、直观的表征手段。

荧光成像的方法为这一难题的解决提供了可行的实验思路。本发明采用蛋白质的荧光染料，对吸附在微分离通道内的蛋白质进行染色，将未结合的染料洗去后，在荧光显微镜下观察，用以进行非特异性蛋白质吸附的表征以及蛋白质涂层性能的评价。

发明内容

本发明涉及一种毛细管和微流控芯片电泳通道中蛋白质的荧光成像表征方法。该方法为研究毛细管和微流控芯片电泳通道中蛋白质的不可逆吸附现象提供一种可视化的、操作简单的表征手段。

本发明的另一目的，在于为蛋白质涂层或者脂质体-蛋白质复合涂层的厚度、均匀性和稳定性的表征提供一种有力的分析方法。

毛细管和微流控芯片电泳通道中蛋白质荧光成像方法，其具体技术方案是：首先，将蛋白质固定到毛细管和微流控芯片电泳通道中，这一过程既可以是在蛋白质的分离过程中发生，也可以是人为地通过物理或化学方法在通道内构建蛋白质涂层；然后，将蛋白质荧光染料充入到微通道内并静置5-60min，进行蛋白质的荧光染色；接着，用无荧光干扰的溶液或溶剂将未结合的荧光染料洗净；最后，在荧光显微镜上，根据荧光染料的激发波长选定观测条件，进行成像观测和图像分析。全部操作过程在4-37℃条件下进行。

其中，荧光染料是指能够与蛋白质发生共价或非共价作用并结合的有机荧光染料，包括但不仅限于：荧光素，异硫氰酸荧光素(FITC)，罗丹明B，四甲基罗丹明(TMR)，SYPROOrange，SYPRO Red，SYPRO Ruby，吖啶红，cy3和cy5。

本发明所涉及的方法，在蛋白质的非特异性吸附以及蛋白质涂层的表征方面，具有操作简单、灵敏度高、直观形象和快速的优点。

附图说明

图1为石英毛细管进样端吸附蛋白质的荧光显微镜图。

图2为聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片电泳通道吸附蛋白质的普通光学显微镜图(1)和荧光显微镜图(2)。

图3为低密度脂蛋白涂层(1)、人血清白蛋白涂层(2)、卵黄蛋白原涂层(3)和无涂层毛细管(4)的荧光显微镜图。

具体实施方式

实施例1石英毛细管上非特异性吸附蛋白质的荧光成像分析

取一支内径为50μm的熔融石英毛细管(总长31cm，有效长度21cm)，接入Beckman MDQ毛细管电泳系统，在+15kY电压、20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、压力进样(0.5psi，5s)条件下，连续5次运行0.2mg/mL蛋白质混合样品(溶菌酶、细胞色素c、核糖核酸酶A和α-糜蛋白酶原A)的分离。操作完成后，将毛细管继续用20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)冲洗10min。