[发明专利]皮下转移的脏器癌荧光原位移植模型建立的方法

权利要求书

1、皮下转移的脏器癌荧光原位移植模型建立的方法，其特征是：选用人结肠腺癌细胞株或相应脏器的癌细胞株绿色荧光蛋白，绿色荧光蛋白GFP质粒通过逆转录病毒pLPCX对脏器的癌细胞株进行转染：使脏器的癌细胞株含有GFP的表达质粒，.GFP基因通过T4连接酶与pLPCX载体连接，GFP-pLPCX载体被转染至PT67包装细胞，得到Lovo细胞；选用裸鼠并在其皮下接种Lovo细胞悬液注入皮下，注射完毕后，对注射部位进行观察，约4周成瘤，肿瘤生长至5mm，观察到绿色荧光后开始进行原位移植；裸鼠腹腔注射麻醉，左腹部碘酊消毒，将皮肽及腹膜剪一小口，将裸鼠肓肠提出腹膜外约1cm，缝合盲肠与腹膜间隙，将盲肠转移至皮下；让切开盲肠浆膜，缝线2块直径约为1mm的携带荧光的肿瘤移植在盲肠处，关闭皮肤。

2、根据权利要求1所述的皮下转移的脏器癌荧光原位移植模型建立的方法，其特征是肿瘤细胞以RPMI-1640培养基，10％小牛血清，在37℃，5％CO2培养，0.25％胰酶-EDTA消化，PBS洗2次，调整细胞浓度制成1×10⁶的细胞悬液。

3.、根据权利要求1所述的皮下转移的脏器癌荧光原位移植模型建立的方法，其特征是逆转录病毒pLPCX.使用含有限制性内切酶Bgl II和Cla I位点的引物扩增GFP片段，PCR产物在纯化后与pLPCX逆转录病毒载体使用限制性内切酶Bgl II和Cla I消化，GFP基因通过T4连接酶与pLPCX载体连接，GFP-pLPCX载体被转染至PT67包装细胞，使用G418选择表达GFP的包装细胞；HT—29细胞在转染前24小时裂解，转染前细胞浓度为20-40％。包装细胞培养在含有10％小牛血清的RPMI1640培养液中，当浓度达到70—80％时候，使用0.45-μm细胞筛进行过滤，然后向HT-29细胞中加入病毒并培养在含有800ug/ml of G418的选择液中。.

4.根据权利要求1所述的皮下转移的脏器癌荧光原位移植模型建立的方法，其特征是裸鼠皮下接种模型的建立时，对裸鼠颈部右侧皮肤消毒，用一次性1mL注射器将Lovo细胞悬液注入皮下0.2mL/只。