[发明专利]皮下转移的脏器癌荧光原位移植模型建立的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种内脏脏器(如结肠等脏器)癌变的研究方法，尤其是结肠癌变原位移植模型建立的方法。

二、背景技术

中国专利CN200710019273.0是本申请发明的一种结直肠癌造口原位移植模型的建立方法，包括以下步骤：a)细胞株选择或进行细胞培养，采用结肠腺癌细胞株细胞浓度制成(1±0.5)×10⁶的细胞悬液；b)对动物活体结肠造口，步骤是，将其盲肠提出腹壁，视实验动物不同长度为0.3-2cm并与周围皮肤固定、愈合；d)造口处肿瘤原位移植，步骤是，取小鼠结肠腺癌细胞混悬液0.1-1ml接种在造口黏膜下，自然生长。但对动物活体结肠造口原位移植模型的建立在研究观察过程中仍有不足之处。

结肠癌原位移植模型的建立对于结肠癌的治疗研究有重要的意义，但是由于结肠癌位置较深，难以观察肿瘤的大小，更无法观察肿瘤转移和复发的情况，在研究中的应用受到一定的限制。荧光蛋白在激发的情况下可以发生荧光，如果移植的肿瘤中携带荧光，这样就可以直接观察到肿瘤的生长、转移的情况。但是如果肿瘤生长在腹腔中，即使有荧光肿瘤观察也不十分容易。

三、发明内容

本发明目的是：提出一种皮下转移的脏器癌荧光原位移植模型建立的方法，尤其是结肠、胰腺等内脏脏器癌荧光原位移植模型建立的方法。

本发明的技术方案是将移植了肿瘤的盲肠转移至皮下，本发明方法使肿瘤生长实验条件更接近于生长在脏器内，而且荧光观察更为容易，是脏器癌研究方法的重要改进。

本发明的技术方案是：皮下转移的脏器癌荧光原位移植模型建立的方法，其特征是：选用人结肠腺癌细胞株或相应脏器的癌细胞株，绿色荧光蛋白(GFP)质粒通过逆转录病毒pLPCX对脏器的癌细胞株进行转染：使脏器的癌细胞株含有GFP的表达质粒，选择表达GFP的包装细胞，然后细胞株中加入病毒并培养在含有800ug/ml ofG418的选择液中。GFP基因通过T4连接酶与pLPCX载体连接，GFP-pLPCX载体被转染至PT67包装细胞，得到转染的癌细胞株.选用裸鼠并在其皮下接种Lovo细胞悬液注入皮下0.2mL/只，注射完毕后，对注射部位进行观察，约4周成瘤，肿瘤生长至5mm，观察到绿色荧光后开始进行原位移植；结肠皮下转移的结肠癌荧光原位移植模型建立：裸鼠腹腔注射麻醉，左腹部碘酊消毒，将皮肤及腹膜剪一小口，将裸鼠肓肠提出腹膜外约1cm，缝合盲肠与腹膜间隙，将盲肠转移至皮下；让切开盲肠浆膜，缝线2块直径约为1mm的携带荧光的肿瘤移植在盲肠处，关闭皮肤。

同样，在胰腺癌模型胃癌建立时，寻找相应的脏器，将脏器的部分转移在皮下，缝合腹膜后，在转移在皮下的部分移植带荧光的组织块，缝合腹部.

四、附图说明

图1：将肿瘤移植在就盲肠处，然后将盲肠移植至皮下的裸鼠照片

图2：皮下肿瘤在荧光灯下显示绿色荧光，可观察肿瘤大小

五、具体实施方式

材料与方法：

1、试验动物：BALB/C nu/nu裸鼠，SPF级，购自北京科丽华实验动物中心，体重24～28g，分笼饲养于独立送风笼具，室温控制在24℃～25℃，相对湿度50％～60％。

2、细胞株及细胞培养：选择相应肿瘤得细胞株，以RPMI-1640培养基，10％小牛血清，在37℃，5％CO2培养，0.25％胰酶-EDTA消化，PBS洗2次，调整细胞浓度制成1×10⁶的细胞悬液。