[发明专利]一种微囊藻毒素-LR定量快速检测传感器的制备及应用

权利要求书

1.一种微囊藻毒素-LR定量快速检测传感器的制备方法，其特征是该检测 传感器为阻抗型电化学传感器，由CHI760C型电化学工作站，三电极体系：免 疫电极为工作电极，饱和甘汞标准电极为参比电极，铂丝电极为对电极组成；将 L-半胱氨酸、胶体金、微囊藻毒素抗体复合物依次分别包被于裸金电极表面制 成免疫电极作工作电极即为藻毒素传感器；步骤为：

(1)电极清洗

先将Φ＝2mm金电极置于Piranha溶液中浸泡10min，再用0.3μm和0.05μm 的Al₂O₃抛光粉将电极表面抛光成镜面，最后金电极分别用等量的硝酸、无水乙 醇、超纯水超声清洗5min，氮气吹干，置于4℃冰箱备用；

(2)电极的修饰

选择L-半胱氨酸-纳米金作为自组装方式，将清洗好的Au电极浸入到pH为 5.0的0.5％的L-半胱氨酸L-Cys中室温下浸置5h，取出用超纯水洗净得到L-Cys修 饰的Au电极，然后浸入纳米金溶胶溶液中4℃自组装12h；

所述纳米金溶胶的配制：用新制双蒸水配制100mL质量浓度为0.01％氯金 酸溶液，置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸，在100r/min磁力搅拌下， 迅速加入预先在37℃保温的质量浓度1％柠檬酸三钠溶液4.5mL，保持温度和转 速不变，继续搅拌加热15min，直至溶液呈现清亮的酒红色，室温冷却，4℃冰 箱保存备用；

(3)检测抗体的包被

藻毒素-LR-KLH免疫得到藻毒素-LR多抗；

用超纯水充分清洗nano-Au/L-Cys/Au修饰电极，然后电极表面滴加10μL 500μg/L的藻毒素-LR多抗溶液，37℃恒温恒湿温育60min后取出，最后滴加10μL 含有1％BSA的PBS溶液，37℃恒温恒湿培育30min后取出，用PBS洗涤，制得的 免疫电极作工作电极即为藻毒素传感器，利用电化学工作站CHI760C，进行样品 中藻毒素的检测，未立即使用的免疫电极需用氮气吹干后，置于pH 7.4的PBS中 于4℃保存待用。

2.如权利要求1所述方法制备的微囊藻毒素-LR定量快速检测传感器产品 的应用方法，其特征是：

(1)绘制检测标准曲线：

取出已制备好的MC-LR免疫电极，平衡至室温，按照浓度从低到高的顺序， 在电极表面依次滴加10μL不同浓度的MC-LR标准溶液，并分别于37℃下孵化 15min后，PBS洗净吹干，均采用循环伏安法CV，交流阻抗法EIS于[Fe(CN)₆]^3-/4-探针电解液中测定工作电极界面的变化，并对电极表面抗体的固定效果进行表 征；CV的测试条件：电压-0.2～0.6V，扫描速度0.1V/S，扫描至稳定；EIS的 测试条件：初始电位为0.2V，振幅0.05V，频率范围为1～100kHz，静置时间2s， 所有测试均在室温下进行，检测时间为3min；

(2)纯净水，矿泉水，自来水出口水的检测：

水样无需前处理，直接进行测定，取10μL待测水样，滴加于免疫电极表面， 37℃恒温恒湿培育15min，PBS洗净吹干，采用循环伏安法CV，交流阻抗法EIS 于[Fe(CN)₆]^3-/4-探针电解液中进行测定，测定条件同上；

(3)天然湖泊水，污水，自来水的检测：

由有机玻璃深水采样器进行采样，采水深度为0.5m以下，采样量为5L；经 砂芯漏斗去除大颗粒杂质，再经过0.45μm滤膜减压过滤，于-20℃低温冰箱中 保存待检；吸取样液10μL，滴加于免疫电极表面，37℃恒温恒湿培育15min后， PBS洗净吹干，采用循环伏安法CV，交流阻抗法EIS于[Fe(CN)₆]^3-/4-探针电解液中 进行测定，测定条件同上；

(4)等效电路计算：计算公式为：

ΔR_et＝R_et(Ab-Ag)-R_et(Ab)

R_et(Ab)：免疫电极封闭后的电子传递阻抗值；

R_et(Ab-Ag)：免疫电极与MC-LR标准品反应后的电极电子传递阻抗值；

ΔR_et：反应前后电子传递阻抗的变化值；

以标准溶液浓度(C)为横坐标，阻抗变化值(ΔR_et)为纵坐标绘制标准曲 线，并根据样液实测阻抗变化值计算水样中微囊藻毒素-LR浓度。