[发明专利]一种微囊藻毒素-LR定量快速检测传感器的制备及应用

说明书

技术领域

一种微囊藻毒素-LR定量快速检测传感器的制备及应用，属于生物技术领 域。

背景技术

藻毒素(Microcystins，简称MC)已成为环境水体中被普遍关注的污染物之 一。MC是一类具有生物活性的环状七肽化合物，主要由淡水藻类铜绿微囊藻产 生，至今已发现MC有70多种异构体。它是一种以肝为靶器官的、高度特异的毒 素，具有明显的肝细胞毒性，随着对MC毒性的深入研究，发现MC具有多器官 毒性、遗传性和致癌性。藻毒素结构主要由N-甲基脱氢丙氨酸及两个L-氨基酸 残基X和Z组成，常见的有MC-LR，RR，YR三种毒素(L、R、Y分别代表亮氨 酸、精氨酸、酪氨酸)，而淡水中尤以MC-LR为主要毒素，藻毒素是一种藻细胞 内毒素，当藻细胞衰老、死亡后，毒素才被释放到水体中。大面积严重的水华 会使水体中的毒素浓度达到mg/L的水平，所以，在水华爆发的夏、秋两季节湖 体中微囊藻毒素的浓度会较高。冬春两季节，部分随着藻细胞和悬浮物沉淀在 沉积物中的毒素，也会在外界因素的影响下慢慢释放出来，有报道沉底泥中吸 附的藻毒素含量达到13mg/L-24mg/L。因此，对饮用水源水中微囊藻毒素的监 测应该是一项长期的工作，分析方法的研究也主要针对MC-LR来建立的。

国内外关于水质监测的方法很多，饮用水源水和自来水中微囊藻毒素的测 定方法主要是高效液相色谱/质谱联用(HPLC-MS)、高效液相色谱(HPLC)、 薄层层析(TLC)、气相色谱(GC)等，其中HPLC为我国生活饮用水卫生标准 推荐采用的测定微囊藻毒素的方法。但是这些方法都费时费力，具有滞后性， 无法对源水进行实时监控。

本发明提出将无标记免疫传感技术应用到微囊藻毒素的监测上，在国内外 尚未见报道，既可以对源水进行实时监测，又可以对水厂饮用水的制备过程进 行实时监控，做到及早知道，及早处理，对于人民生活安定，社会的和谐会有 着巨大的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种微囊藻毒素-LR定量快速检测传感器的制备及应 用，该方法主要利用抗原抗体反应的高特异性、电化学信号的高灵敏性以及现 代信息技术的高智能化相结合，构建无标记型电化学免疫传感装置，实现自来 水水源、水处理过程及出厂水中微囊藻毒素的实时快速全自动监测。

本发明的技术方案：一种微囊藻毒素-LR定量快速检测传感器的制备方法， 该检测传感器为阻抗型电化学传感器，由CHI760C型电化学工作站，三电极体 系：免疫电极为工作电极，饱和甘汞标准电极为参比电极，铂丝电极为对电极组 成；将L-半胱氨酸、胶体金、微囊藻毒素抗体复合物依次分别包被于裸金电极 表面制成免疫电极作工作电极即为藻毒素传感器；步骤为：

(1)电极清洗

先将Φ＝2mm金电极置于Piranha溶液中浸泡10min，再用0.3μm和0.05μm 的Al₂O₃抛光粉将电极表面抛光成镜面，最后分别用金电极等量的硝酸、无水乙 醇、超纯水超声清洗5min，氮气吹干，置于4℃冰箱备用；

(2)电极的修饰

选择L-半胱氨酸-纳米金作为自组装方式，将清洗好的Au电极浸入到pH为 5.0的0.5％的L-半胱氨酸L-Cys中室温下浸置5h，取出用超纯水洗净得到L-Cys修 饰的Au电极，然后浸入纳米金溶胶溶液中4℃自组装12h；

所述纳米金溶胶的配置：用新制双蒸水配制100mL质量浓度为0.01％氯金 酸溶液，置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸，在100r/min磁力搅拌下， 迅速加入预先在37℃保温的质量浓度1％柠檬酸三钠溶液4.5mL，保持温度和转 速不变，继续搅拌加热15min，直至溶液呈现清亮的酒红色，室温冷却，4℃冰 箱保存备用；

(3)检测抗体的包被

藻毒素-LR-KLH免疫得到藻毒素-LR多抗；

用超纯水充分清洗nano-Au/L-Cys/Au修饰电极，然后电极表面滴加10μL 500μg/L的藻毒素-LR多抗溶液，37℃恒温恒湿温育60min后取出，最后滴加10μL 含有1％BSA的PBS溶液，37℃恒温恒湿培育30min后取出，用PBS洗涤，制得的 免疫电极作工作电极即为藻毒素传感器，利用电化学工作站CHI760C，进行样品 中藻毒素的检测，未立即使用的免疫电极需用氮气吹干后，置于pH 7.4的PBS中 于4℃保存待用。